劉志強(qiáng)，馮建彬，邱高峰

（上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部淡水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

調(diào)控果蠅（Drosophila melanogaster）幼體體節(jié)發(fā)育的 Winless基因［1］和小鼠（Mus musculus）乳腺瘤整合過程中發(fā)揮調(diào)控作用的int-1基因［2］屬于同源基因，兩類基因統(tǒng)稱為 Wnt基因［3］。Wnt基因是一個(gè)大的基因家族［4］，Wnt-4基因是 Wnt家族重要的成員［5］，目前已在哺乳類［6-7］，鳥類［8］、魚類［9］、兩棲類［5］、爬行類［10］、軟體動(dòng)物［11-12］等物種中均有發(fā)現(xiàn)。并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)其編碼的WNT-4蛋白在許多生物事件中都發(fā)揮著重要的作用，如在雌性哺乳動(dòng)物中WNT-4能夠抑制性腺分泌雄性激素，從而導(dǎo)致雌性個(gè)體內(nèi)雄性生殖細(xì)胞的分化，當(dāng)雌性個(gè)體內(nèi)Wnt-4基因缺失或突變后會(huì)導(dǎo)致繆勒氏管缺失和雄性化［6］。在雄性個(gè)體胚胎發(fā)育時(shí)，Wnt-4的過表達(dá)會(huì)使個(gè)體雄性激素分泌降低而導(dǎo)致睪丸發(fā)育受到影響，個(gè)體雌性化發(fā)育［7］；在鳥類和魚類中，Wnt-4在發(fā)育的腦組織中高表達(dá)，并且能夠抑制細(xì)胞的遷移［13-14］；在果蠅中，Wnt-4被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜成像的特異性［15］；而在一些軟體動(dòng)物中，Wnt-4在不同組織中均有表達(dá)的特征［11-12］，說明其可能參與軟體動(dòng)物的多種生命活動(dòng)。

Wnt-4作為重要的調(diào)控因子，在許多生物中已有深入的研究，但是迄今為止在蝦蟹等甲殼類生物中尚未見Wnt-4基因的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得了中華絨螯蟹EsWnt-4基因的cDNA序列，然后對(duì)該基因在中華絨螯蟹不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，最后對(duì)該基因在不同發(fā)育時(shí)期的胚胎、幼體及仔蟹中的表達(dá)量進(jìn)行了分析，以期為中華絨螯蟹EsWnt-4基因的功能研究及其它蝦蟹類生物中Wnt基因的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

EsWnt-4基因組織分布檢測(cè)所用中華絨螯蟹于2016年10月購(gòu)自上海市浦東新區(qū)南匯果園市場(chǎng)，其中雌蟹個(gè)體體長(zhǎng)為4.5 cm，體寬為4.8 cm，體質(zhì)量為96 g；雄蟹個(gè)體體長(zhǎng)為5.1 cm，體寬為5.2 cm，體質(zhì)量為104 g。待其冰上冷凍麻醉后將其解剖，取其精巢、卵巢、肌肉、心臟、鰓、肝胰腺、胸腹神經(jīng)團(tuán)、腦、眼柄等組織，迅速置入液氮中冷凍，然后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抱卵期的中華絨螯蟹由上海海洋大學(xué)吳旭干老師于2015年1月提供，并在解剖鏡下追蹤其受精卵的發(fā)育時(shí)期，分別采集受精卵、1細(xì)胞期、2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、原溞狀體期等不同胚胎發(fā)育時(shí)期的樣品置于液氮中，并轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)之前描述的中華絨螯蟹幼體發(fā)育時(shí)期的分期方式，在2016年4—6月份自啟東蟹苗養(yǎng)殖場(chǎng)采集中華絨螯蟹不同發(fā)育時(shí)期的幼體，包括第一溞狀幼體、第二溞狀幼體、第三溞狀幼體、第四溞狀幼體、第五溞狀幼體、大眼幼體，將其置于液氮中，并轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩⒉糠执笱塾左w帶至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行養(yǎng)殖，待其發(fā)育到不同仔蟹時(shí)期時(shí)進(jìn)行樣品采集，用于RNA提取。

1.2 樣品RNA的提取

根據(jù)Trizol試劑操作說明書提取所需樣品的總RNA，具體操作為：取250μL Trizol試劑迅速加入-80℃保存的樣品中，冰上充分勻漿后再加入750μL的 Trizol，劇烈震蕩15 s，冰上放置5 min；加入200μL氯仿，顛倒混勻，冰上放置3 min；12 000 r·min-1、4℃離心 15 min；取上清至新的離心管中，加入500μL異丙醇，混勻，靜置10 min；12 000 r·min-1、4℃離心 10 min；棄上清，加入1 mL75%乙醇，并用移液器吹打沉淀，然后75 000 r·min-1、4℃離心 5 min；小心的去除上清，待干燥后加入40μL無(wú)酶水；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度。

1.3 EsWnt-4 cDNA序列篩選及驗(yàn)證

對(duì)中華絨螯蟹卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，BLSAT及NJ聚類分析篩選出EsWnt-4基因的轉(zhuǎn)錄本序列（GenBank accession number：MH707438）。根據(jù)從轉(zhuǎn)錄組中獲得的轉(zhuǎn)錄本序列的 3′及 5′端序列設(shè)計(jì)引物 EsWnt-4F1（5′-GAGGAGGAGGGGGAGGAGG-3′） 和 EsWnt-4R1（5′-GACCGCAACCTTCCGACG-3′），對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，并設(shè)計(jì)用于RT-PCR和熒光定量檢測(cè) 時(shí) 的 上 下 游 引 物 （EsWnt-4F2：5′-AAGCAATGCCCAGCTTCAGG-3′和 EsWnt-4R2：5′-GGAGCCGCTGTTGATGTCGT-3′）。

1.4 EsWnt-4 mRNA的組織分布檢測(cè)

分別取2μg各組織總RNA，用DNase去除樣品總 RNA中可能混有的基因組 DNA。使用Prime Script II 1st Strand c DNA Synthesis Kit合成c DNA第一條鏈，并以中華絨螯蟹β-actin基因的上下游引物（β-actinF：5′-CGACGGTCAGGTC ATCACC-3′和 β-actinF ：5′-ACGTCGCACTTC ATGATGGA-3′）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄效果。隨后以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2為上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)EsWnt-4在中華絨螯蟹不同組織的表達(dá)情況。

1.5 EsWnt-4在胚胎及幼體時(shí)期的表達(dá)檢測(cè)

分別取中華絨螯蟹成熟的卵細(xì)胞、不同發(fā)育時(shí)期的胚胎及不同幼體時(shí)期樣品的總RNA 2μg，按照1.4操作步驟反轉(zhuǎn)錄獲得各樣品的cDNA。以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2為上下游引物，檢測(cè)EsWnt-4在中華絨螯蟹受精卵、胚胎期、幼體期和仔蟹時(shí)期的表達(dá)情況。β-actin基因的表達(dá)量作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹Wnt cDNA序列特征

從中華絨螯蟹卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得一個(gè)被注釋為Wnt-4的RNA序列，長(zhǎng)為1 027 bp，分析后發(fā)現(xiàn)其5′UTR為39 bp，3′UTR為155 bp，ORF為831 bp，其中在5′UTR處有一個(gè)核心堿基為“GGA”的微衛(wèi)星片段（圖1）。另外，ORF編碼一個(gè)含277個(gè)氨基酸殘基的多肽，其等電點(diǎn)為8.97，蛋白分子量為29.37Kd。另外，BLAST檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)該多肽含有一個(gè)WNT蛋白家族的保守區(qū)（圖1）。

2.2 序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 NCBI上 BLAST在線軟件對(duì) EsWnt-4 ORF編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該多肽與節(jié)肢動(dòng)物里絨蟲 （Euperipotaidei kanangrensis）的WNT-4在保守區(qū)的同源性高達(dá)98%，與其它脊椎動(dòng)物如人、牛等物種的WNT-4也有97%的同源性。隨后，選取不同物種、不同亞族的WNT氨基酸進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，中華絨螯蟹的WNT首先與絨蟲的WNT-4聚為一支，隨后再和其它脊椎動(dòng)物的WNT-4聚為一支。而其它亞族各成員也以很高的置信度分別聚在一起（圖2）?；诖?，將該實(shí)驗(yàn)克隆得到的 WNT基因命名為EsWnt-4。

圖1 中華絨螯蟹Wnt基因cDNA序列及其編碼的多肽序列Fig 1 The cDNA sequence of EsWnt gene and the deduced amino acids sequence注：灰色陰影標(biāo)注的為微衛(wèi)星序列，黑線標(biāo)注的為WNT蛋白家族的保守區(qū)Note：The SSR sequence was marked with gray shade，the conservative region of WNT protein was underlined

圖2 不同物種WNT氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of different WNT amino acids sequences

2.3 EsWnt-4在中華絨螯蟹各組織中的表達(dá)情況

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，EsWnt-4在肌肉、肝胰腺、眼柄、鰓中不表達(dá)，在精巢、卵巢、胸腹神經(jīng)團(tuán)、心臟、腦中均有表達(dá)，但是表達(dá)量不同，其中在心臟、腦中的表達(dá)量最高，其次是精巢、卵巢，而在胸腹神經(jīng)團(tuán)中的表達(dá)量最低（圖3）。

圖3 EsWnt-4在成體中華絨螯蟹不同組織中的表達(dá)情況Fig.3 Expression of EsWnt-4 in different tissues of adult Eriocheir sinensis注：M：100bp DNA maker；Te：精巢；Ov：卵巢；Tg：胸腹神經(jīng)團(tuán)；He：心臟；Mu：肌肉；Hp：肝胰腺；Ey：眼柄；Br：腦；Gi：鰓Note：M：100bp DNA maker；Te：testis；Ov：ovary；Tg：thoracic ganglion；He： heart；Mu： muscle；Hp： hepatopancreas；Ey：eyestalk；Br：brain；Gi：gill

2.4 EsWnt-4在中華絨螯蟹胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)量檢測(cè)

熒光定量PCR結(jié)果顯示，在成熟的卵母細(xì)胞及所檢測(cè)的各時(shí)期胚胎內(nèi)，EsWnt-4都有表達(dá)。其中，成熟的卵母細(xì)胞中EsWnt-4含量較低，受精后其含量升高。在開始卵裂以后EsWnt-4含量下降，直到8細(xì)胞時(shí)期EsWnt-4含量均低于其在受精卵中的含量。在16細(xì)胞期EsWnt-4表達(dá)量驟增至最大，隨后其表達(dá)量又急劇下降，并在以后的胚胎發(fā)育期內(nèi)均保持較低的表達(dá)量。

圖4 EsWnt-4在中華絨螯蟹成熟卵細(xì)胞及胚胎時(shí)期的表達(dá)情況Fig.4 Relative expression of EsWnt-4 in mature eggs and embryos in different developmental stages of Eriocheir sinensis注：a：成熟卵細(xì)胞；b：受精卵；c：2細(xì)胞；d：4細(xì)胞；e：8細(xì)胞；f：16細(xì)胞；g：囊胚；h：原腸胚；i：原溞狀體。*表示顯著性差異（P＜0.05）Note：a：mature eggs；b：fertilized eggs；c：2-cell stage；d：4-cell stage；e：8-cell stage；f：16-cell stage；g：blastocyst；h：gastrula；i：protozoea.*indicate significant differences statistically（P＜0.05）

2.5 EsWnt-4在中華絨螯蟹胚胎幼體及仔蟹中的表達(dá)量檢測(cè)

為了初步探索EsWnt-4基因在溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹等發(fā)育過程中的作用，筆者對(duì)第一至第五溞狀幼體階段、大眼幼體階段及一期和二期仔蟹時(shí)期樣品的RNA進(jìn)行抽提，利用熒光定量PCR對(duì)EsWnt-4基因在這些時(shí)期內(nèi)的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，在溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹中EsWnt-4基因均有表達(dá)，但是在第一溞狀幼體、第三溞狀幼體、第四溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹中EsWnt-4基因的表達(dá)量非常低，而在第二溞狀幼體及第五溞狀幼體時(shí)期EsWnt-4基因的表達(dá)量顯著高于其它時(shí)期，且第五溞狀幼體時(shí)期EsWnt-4基因表達(dá)量最高。

圖5 EsWnt-4在中華絨螯蟹不同幼體及仔蟹時(shí)期的表達(dá)情況Fig.5 Relative expression of EsWnt-4 in larvae and juvenile Eriocheir sinensis注：j：第一溞狀幼體；k：第二溞狀幼體；l：第三溞狀幼體；m：第四溞狀幼體；n：第五溞狀幼體；o：大眼幼體；p：第一仔蟹；q：第二仔蟹。*與**之間有顯著性差異（P＜0.05）Note：j：zoea-1larvae；k：zoea-2 larvae；l：zoea-3 larvae；m：zoea-4 larvae；n：zoea-5 larvae；o：megalopa；p：juvenile-1 crab；q：juvenile-2 crab.*and**indicate significant differences statistically（P＜0.05）

3 討論

Wnt-4在多種生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用，如哺乳動(dòng)物性別分化［6-7］，果蠅體節(jié)的形成和視網(wǎng)膜成像［1，15］，鳥類和魚類生物神經(jīng)組織的發(fā)育［4，14］等。此 外，在 櫛 孔 扇 貝 （Chlamys farreri）［11］、厚殼貽貝（Mytilus coruscus）［12］等生物中，Wnt-4在不同的組織中都有表達(dá)，說明在這些物種中Wnt-4的功能并不單一。與此相同的是，中華絨螯蟹EsWnt-4基因在神經(jīng)組織、心臟、性腺組織中均有表達(dá)，說明Wnt-4在中華絨螯蟹中也具有多種功能。

通常認(rèn)為，在受精的過程中，精子僅將自身的遺傳物質(zhì)及組蛋白攜帶至受精卵中。但近期研究發(fā)現(xiàn)，精子在受精時(shí)還會(huì)將一些調(diào)控因子或調(diào)控因子的mRNA攜帶至受精卵中［16-19］。如在小鼠中，Wnt-4的mRNA便可由精子攜帶至受精卵中，并且該轉(zhuǎn)錄本還可以在早期的胚胎發(fā)育時(shí)翻譯成蛋白，發(fā)揮功能［19］。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹成熟的卵細(xì)胞中EsWnt-4基因的表達(dá)量很低，受精后其表達(dá)量明顯上升，而在其后的2、4、8細(xì)胞期EsWnt-4的表達(dá)量又遠(yuǎn)低于受精卵時(shí)期，因此筆者推測(cè)，中華絨螯蟹的精子也可以將EsWnt-4基因的轉(zhuǎn)錄本攜帶至受精卵中。此外，胚胎發(fā)育的早期，由精子和卵細(xì)胞繼承的基因處于沉寂狀態(tài)，需要等到一定的發(fā)育階段后才可以重新被激活并開始轉(zhuǎn)錄，完成受精卵的生命活動(dòng)由母型調(diào)控向合子型調(diào)控的過渡［20］。不同種類物種胚胎基因被激活的時(shí)期各不相同。在果蠅、小鼠中來(lái)自親本的遺傳物質(zhì)被重新激活是在2細(xì)胞期［21-23］；牛（Bos taurus）胚胎基因組的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在 8細(xì)胞期［24］；綿羊（Ovis aries）胚胎中合子基因組啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)間大約發(fā)生在16細(xì)胞期［25］。但是，最近有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在一些生物中，受精卵的生命活動(dòng)由母性調(diào)控向合子型調(diào)控過渡在精子與卵子染色體融合形成受精卵后就已經(jīng)開始。因此，中華絨螯蟹受精卵中EsWnt-4 mRNA含量上升也有可能是受精卵自身基因被激活后轉(zhuǎn)錄所致。

在果蠅發(fā)育的早期，WNT4能夠調(diào)控體節(jié)的發(fā)育［1］，中華絨螯蟹EsWnt-4基因在第二溞狀幼體時(shí)期表達(dá)量迅速上升，而第二溞狀幼體發(fā)育為第三溞狀幼體時(shí)其腹節(jié)將會(huì)增加（由6節(jié)變?yōu)?節(jié)）［26］，說明EsWnt-4可能與中華絨螯蟹幼體發(fā)育時(shí)體節(jié)的形成有關(guān)。溞狀幼體變?yōu)榇笱塾左w后，中華絨螯蟹個(gè)體會(huì)發(fā)生非常明顯的形態(tài)學(xué)變化，包括頭胸甲的形成、螯足的出現(xiàn)［26］等。EsWnt-4在第五溞狀幼體時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，說明該基因在中華絨螯蟹由溞狀幼體變?yōu)榇笱塾左w的過程中具有非常重要的作用。