劉志強,馮建彬,邱高峰
(上海海洋大學,農(nóng)業(yè)部淡水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心,上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 201306)
調(diào)控果蠅(Drosophila melanogaster)幼體體節(jié)發(fā)育的 Winless基因[1]和小鼠(Mus musculus)乳腺瘤整合過程中發(fā)揮調(diào)控作用的int-1基因[2]屬于同源基因,兩類基因統(tǒng)稱為 Wnt基因[3]。Wnt基因是一個大的基因家族[4],Wnt-4基因是 Wnt家族重要的成員[5],目前已在哺乳類[6-7],鳥類[8]、魚類[9]、兩棲類[5]、爬行類[10]、軟體動物[11-12]等物種中均有發(fā)現(xiàn)。并且實驗證實其編碼的WNT-4蛋白在許多生物事件中都發(fā)揮著重要的作用,如在雌性哺乳動物中WNT-4能夠抑制性腺分泌雄性激素,從而導致雌性個體內(nèi)雄性生殖細胞的分化,當雌性個體內(nèi)Wnt-4基因缺失或突變后會導致繆勒氏管缺失和雄性化[6]。在雄性個體胚胎發(fā)育時,Wnt-4的過表達會使個體雄性激素分泌降低而導致睪丸發(fā)育受到影響,個體雌性化發(fā)育[7];在鳥類和魚類中,Wnt-4在發(fā)育的腦組織中高表達,并且能夠抑制細胞的遷移[13-14];在果蠅中,Wnt-4被證實能夠調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜成像的特異性[15];而在一些軟體動物中,Wnt-4在不同組織中均有表達的特征[11-12],說明其可能參與軟體動物的多種生命活動。
Wnt-4作為重要的調(diào)控因子,在許多生物中已有深入的研究,但是迄今為止在蝦蟹等甲殼類生物中尚未見Wnt-4基因的報道。本實驗從中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得了中華絨螯蟹EsWnt-4基因的cDNA序列,然后對該基因在中華絨螯蟹不同組織的表達情況進行了RT-PCR檢測,最后對該基因在不同發(fā)育時期的胚胎、幼體及仔蟹中的表達量進行了分析,以期為中華絨螯蟹EsWnt-4基因的功能研究及其它蝦蟹類生物中Wnt基因的研究提供基礎(chǔ)資料。
EsWnt-4基因組織分布檢測所用中華絨螯蟹于2016年10月購自上海市浦東新區(qū)南匯果園市場,其中雌蟹個體體長為4.5 cm,體寬為4.8 cm,體質(zhì)量為96 g;雄蟹個體體長為5.1 cm,體寬為5.2 cm,體質(zhì)量為104 g。待其冰上冷凍麻醉后將其解剖,取其精巢、卵巢、肌肉、心臟、鰓、肝胰腺、胸腹神經(jīng)團、腦、眼柄等組織,迅速置入液氮中冷凍,然后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
抱卵期的中華絨螯蟹由上海海洋大學吳旭干老師于2015年1月提供,并在解剖鏡下追蹤其受精卵的發(fā)育時期,分別采集受精卵、1細胞期、2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、囊胚期、原腸胚期、原溞狀體期等不同胚胎發(fā)育時期的樣品置于液氮中,并轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)之前描述的中華絨螯蟹幼體發(fā)育時期的分期方式,在2016年4—6月份自啟東蟹苗養(yǎng)殖場采集中華絨螯蟹不同發(fā)育時期的幼體,包括第一溞狀幼體、第二溞狀幼體、第三溞狀幼體、第四溞狀幼體、第五溞狀幼體、大眼幼體,將其置于液氮中,并轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆?。將部分大眼幼體帶至實驗室進行養(yǎng)殖,待其發(fā)育到不同仔蟹時期時進行樣品采集,用于RNA提取。
根據(jù)Trizol試劑操作說明書提取所需樣品的總RNA,具體操作為:取250μL Trizol試劑迅速加入-80℃保存的樣品中,冰上充分勻漿后再加入750μL的 Trizol,劇烈震蕩15 s,冰上放置5 min;加入200μL氯仿,顛倒混勻,冰上放置3 min;12 000 r·min-1、4℃離心 15 min;取上清至新的離心管中,加入500μL異丙醇,混勻,靜置10 min;12 000 r·min-1、4℃離心 10 min;棄上清,加入1 mL75%乙醇,并用移液器吹打沉淀,然后75 000 r·min-1、4℃離心 5 min;小心的去除上清,待干燥后加入40μL無酶水;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,酶標儀測定其濃度。
對中華絨螯蟹卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行搜索,BLSAT及NJ聚類分析篩選出EsWnt-4基因的轉(zhuǎn)錄本序列(GenBank accession number:MH707438)。根據(jù)從轉(zhuǎn)錄組中獲得的轉(zhuǎn)錄本序列的 3′及 5′端序列設計引物 EsWnt-4F1(5′-GAGGAGGAGGGGGAGGAGG-3′) 和 EsWnt-4R1(5′-GACCGCAACCTTCCGACG-3′),對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行驗證,并設計用于RT-PCR和熒光定量檢測 時 的 上 下 游 引 物 (EsWnt-4F2:5′-AAGCAATGCCCAGCTTCAGG-3′和 EsWnt-4R2:5′-GGAGCCGCTGTTGATGTCGT-3′)。
分別取2μg各組織總RNA,用DNase去除樣品總 RNA中可能混有的基因組 DNA。使用Prime Script II 1st Strand c DNA Synthesis Kit合成c DNA第一條鏈,并以中華絨螯蟹β-actin基因的上下游引物(β-actinF:5′-CGACGGTCAGGTC ATCACC-3′和 β-actinF :5′-ACGTCGCACTTC ATGATGGA-3′)進行 PCR擴增,檢測反轉(zhuǎn)錄效果。隨后以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2為上下游引物進行擴增,檢測EsWnt-4在中華絨螯蟹不同組織的表達情況。
分別取中華絨螯蟹成熟的卵細胞、不同發(fā)育時期的胚胎及不同幼體時期樣品的總RNA 2μg,按照1.4操作步驟反轉(zhuǎn)錄獲得各樣品的cDNA。以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2為上下游引物,檢測EsWnt-4在中華絨螯蟹受精卵、胚胎期、幼體期和仔蟹時期的表達情況。β-actin基因的表達量作為內(nèi)參,采用2-△△Ct法對基因的相對表達量進行分析,使用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
從中華絨螯蟹卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得一個被注釋為Wnt-4的RNA序列,長為1 027 bp,分析后發(fā)現(xiàn)其5′UTR為39 bp,3′UTR為155 bp,ORF為831 bp,其中在5′UTR處有一個核心堿基為“GGA”的微衛(wèi)星片段(圖1)。另外,ORF編碼一個含277個氨基酸殘基的多肽,其等電點為8.97,蛋白分子量為29.37Kd。另外,BLAST檢測后發(fā)現(xiàn)該多肽含有一個WNT蛋白家族的保守區(qū)(圖1)。
利用 NCBI上 BLAST在線軟件對 EsWnt-4 ORF編碼的氨基酸序列進行分析,發(fā)現(xiàn)該多肽與節(jié)肢動物里絨蟲 (Euperipotaidei kanangrensis)的WNT-4在保守區(qū)的同源性高達98%,與其它脊椎動物如人、牛等物種的WNT-4也有97%的同源性。隨后,選取不同物種、不同亞族的WNT氨基酸進行聚類分析,結(jié)果顯示,中華絨螯蟹的WNT首先與絨蟲的WNT-4聚為一支,隨后再和其它脊椎動物的WNT-4聚為一支。而其它亞族各成員也以很高的置信度分別聚在一起(圖2)?;诖?,將該實驗克隆得到的 WNT基因命名為EsWnt-4。
圖1 中華絨螯蟹Wnt基因cDNA序列及其編碼的多肽序列Fig 1 The cDNA sequence of EsWnt gene and the deduced amino acids sequence注:灰色陰影標注的為微衛(wèi)星序列,黑線標注的為WNT蛋白家族的保守區(qū)Note:The SSR sequence was marked with gray shade,the conservative region of WNT protein was underlined
圖2 不同物種WNT氨基酸的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of different WNT amino acids sequences
RT-PCR檢測結(jié)果顯示,EsWnt-4在肌肉、肝胰腺、眼柄、鰓中不表達,在精巢、卵巢、胸腹神經(jīng)團、心臟、腦中均有表達,但是表達量不同,其中在心臟、腦中的表達量最高,其次是精巢、卵巢,而在胸腹神經(jīng)團中的表達量最低(圖3)。
圖3 EsWnt-4在成體中華絨螯蟹不同組織中的表達情況Fig.3 Expression of EsWnt-4 in different tissues of adult Eriocheir sinensis注:M:100bp DNA maker;Te:精巢;Ov:卵巢;Tg:胸腹神經(jīng)團;He:心臟;Mu:肌肉;Hp:肝胰腺;Ey:眼柄;Br:腦;Gi:鰓Note:M:100bp DNA maker;Te:testis;Ov:ovary;Tg:thoracic ganglion;He: heart;Mu: muscle;Hp: hepatopancreas;Ey:eyestalk;Br:brain;Gi:gill
熒光定量PCR結(jié)果顯示,在成熟的卵母細胞及所檢測的各時期胚胎內(nèi),EsWnt-4都有表達。其中,成熟的卵母細胞中EsWnt-4含量較低,受精后其含量升高。在開始卵裂以后EsWnt-4含量下降,直到8細胞時期EsWnt-4含量均低于其在受精卵中的含量。在16細胞期EsWnt-4表達量驟增至最大,隨后其表達量又急劇下降,并在以后的胚胎發(fā)育期內(nèi)均保持較低的表達量。
圖4 EsWnt-4在中華絨螯蟹成熟卵細胞及胚胎時期的表達情況Fig.4 Relative expression of EsWnt-4 in mature eggs and embryos in different developmental stages of Eriocheir sinensis注:a:成熟卵細胞;b:受精卵;c:2細胞;d:4細胞;e:8細胞;f:16細胞;g:囊胚;h:原腸胚;i:原溞狀體。*表示顯著性差異(P<0.05)Note:a:mature eggs;b:fertilized eggs;c:2-cell stage;d:4-cell stage;e:8-cell stage;f:16-cell stage;g:blastocyst;h:gastrula;i:protozoea.*indicate significant differences statistically(P<0.05)
為了初步探索EsWnt-4基因在溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹等發(fā)育過程中的作用,筆者對第一至第五溞狀幼體階段、大眼幼體階段及一期和二期仔蟹時期樣品的RNA進行抽提,利用熒光定量PCR對EsWnt-4基因在這些時期內(nèi)的表達量進行了測定。結(jié)果顯示,在溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹中EsWnt-4基因均有表達,但是在第一溞狀幼體、第三溞狀幼體、第四溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹中EsWnt-4基因的表達量非常低,而在第二溞狀幼體及第五溞狀幼體時期EsWnt-4基因的表達量顯著高于其它時期,且第五溞狀幼體時期EsWnt-4基因表達量最高。
圖5 EsWnt-4在中華絨螯蟹不同幼體及仔蟹時期的表達情況Fig.5 Relative expression of EsWnt-4 in larvae and juvenile Eriocheir sinensis注:j:第一溞狀幼體;k:第二溞狀幼體;l:第三溞狀幼體;m:第四溞狀幼體;n:第五溞狀幼體;o:大眼幼體;p:第一仔蟹;q:第二仔蟹。*與**之間有顯著性差異(P<0.05)Note:j:zoea-1larvae;k:zoea-2 larvae;l:zoea-3 larvae;m:zoea-4 larvae;n:zoea-5 larvae;o:megalopa;p:juvenile-1 crab;q:juvenile-2 crab.*and**indicate significant differences statistically(P<0.05)
Wnt-4在多種生命活動中具有重要的調(diào)控作用,如哺乳動物性別分化[6-7],果蠅體節(jié)的形成和視網(wǎng)膜成像[1,15],鳥類和魚類生物神經(jīng)組織的發(fā)育[4,14]等。此 外,在 櫛 孔 扇 貝 (Chlamys farreri)[11]、厚殼貽貝(Mytilus coruscus)[12]等生物中,Wnt-4在不同的組織中都有表達,說明在這些物種中Wnt-4的功能并不單一。與此相同的是,中華絨螯蟹EsWnt-4基因在神經(jīng)組織、心臟、性腺組織中均有表達,說明Wnt-4在中華絨螯蟹中也具有多種功能。
通常認為,在受精的過程中,精子僅將自身的遺傳物質(zhì)及組蛋白攜帶至受精卵中。但近期研究發(fā)現(xiàn),精子在受精時還會將一些調(diào)控因子或調(diào)控因子的mRNA攜帶至受精卵中[16-19]。如在小鼠中,Wnt-4的mRNA便可由精子攜帶至受精卵中,并且該轉(zhuǎn)錄本還可以在早期的胚胎發(fā)育時翻譯成蛋白,發(fā)揮功能[19]。在本實驗中發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹成熟的卵細胞中EsWnt-4基因的表達量很低,受精后其表達量明顯上升,而在其后的2、4、8細胞期EsWnt-4的表達量又遠低于受精卵時期,因此筆者推測,中華絨螯蟹的精子也可以將EsWnt-4基因的轉(zhuǎn)錄本攜帶至受精卵中。此外,胚胎發(fā)育的早期,由精子和卵細胞繼承的基因處于沉寂狀態(tài),需要等到一定的發(fā)育階段后才可以重新被激活并開始轉(zhuǎn)錄,完成受精卵的生命活動由母型調(diào)控向合子型調(diào)控的過渡[20]。不同種類物種胚胎基因被激活的時期各不相同。在果蠅、小鼠中來自親本的遺傳物質(zhì)被重新激活是在2細胞期[21-23];牛(Bos taurus)胚胎基因組的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在 8細胞期[24];綿羊(Ovis aries)胚胎中合子基因組啟動轉(zhuǎn)錄時間大約發(fā)生在16細胞期[25]。但是,最近有實驗證實,在一些生物中,受精卵的生命活動由母性調(diào)控向合子型調(diào)控過渡在精子與卵子染色體融合形成受精卵后就已經(jīng)開始。因此,中華絨螯蟹受精卵中EsWnt-4 mRNA含量上升也有可能是受精卵自身基因被激活后轉(zhuǎn)錄所致。
在果蠅發(fā)育的早期,WNT4能夠調(diào)控體節(jié)的發(fā)育[1],中華絨螯蟹EsWnt-4基因在第二溞狀幼體時期表達量迅速上升,而第二溞狀幼體發(fā)育為第三溞狀幼體時其腹節(jié)將會增加(由6節(jié)變?yōu)?節(jié))[26],說明EsWnt-4可能與中華絨螯蟹幼體發(fā)育時體節(jié)的形成有關(guān)。溞狀幼體變?yōu)榇笱塾左w后,中華絨螯蟹個體會發(fā)生非常明顯的形態(tài)學變化,包括頭胸甲的形成、螯足的出現(xiàn)[26]等。EsWnt-4在第五溞狀幼體時表達量達到最大,說明該基因在中華絨螯蟹由溞狀幼體變?yōu)榇笱塾左w的過程中具有非常重要的作用。