劉 婷，馬增嶺，李 慧，徐智廣

（1.溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035；2.魯東大學生命科學學院，山東煙臺 264025）

固著生長的馬尾藻（Sargassum）斷裂后漂浮在海面上，暴發(fā)性生長而出現(xiàn)生物量大規(guī)模聚集在海水表面的生態(tài)現(xiàn)象稱之為金潮［1］。近年來，墨西哥灣、西非、加勒比海、巴西等世界多地沿海海岸線頻繁暴發(fā)金潮，而自2015年以來，漂浮馬尾藻在我國黃海及東海近海發(fā)現(xiàn)頻次和分布面積也呈大幅上升態(tài)勢，2016年底江蘇省暴發(fā)銅藻（Sargassum horneri）金潮，大量銅藻的堆積導致南通、鹽城海域的紫菜養(yǎng)殖筏架大面積垮塌，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了毀滅性破壞。因而，繼綠潮之后，金潮可能成為另一個對我國沿海地區(qū)造成巨大影響的生態(tài)災害［2-3］。馬尾藻金潮的形成與光照 、溫度 、N／P營養(yǎng)、pH等環(huán)境因子的變化可能存在著一定的關系［3］。與此同時，人類活動導致的大氣CO2濃度持續(xù)升高，使得海水碳酸鹽系統(tǒng)發(fā)生改變，勢必會影響金潮藻的光合固碳過程［4-5］，而金潮藻對外源無機碳的吸收利用特點極可能影響著金潮的暴發(fā)與否。實際上，對淡水藻水華的研究已經(jīng)證實，藍藻水華從形成到暴發(fā)與藍藻自身對外源無機碳的吸收利用關系密切［6］。

藻類進行光合作用的碳源主要來自海水中的溶解性無機碳［7］。海水中的無機碳形式主要有 CO2、和。絕大多數(shù)藻類可以通過跨膜擴散直接利用溶解在海水中的CO2，而有些藻類不僅可以利用海水中的CO2，還能夠通過耗能的陰離子交換蛋白來實現(xiàn)對的直接利用，如石莼（Ulva lactuca）、長襄水云（Ectocarpus siliculosus）、掌狀紅皮藻（Palmaria palmata）和壇紫菜（Porphyra haitanensi）自由絲狀體［8-11］。此外，還有些藻類在海水中可以經(jīng)胞外碳酸酐酶（CA）將轉(zhuǎn)化為 CO2再進行吸收利用，如條斑紫菜（Porphyra haitanensi）葉狀體能夠利用胞外碳酸酐酶催化海水中快速轉(zhuǎn)化為CO2后將 其吸 收［12］。而在 細 基 江 蘺 （Gracilaria gaditana）中同時存在直接和間接兩種利用方式［13］。因此，藻類利用主要有3種方式：利用陰離子交換蛋白的直接吸收、利用胞外碳酸酐酶的間接吸收以及同時具備以上兩種方式［14］。由此可見，不同藻類具有不同的無機碳利用機制，而同一藻類可能同時具有多種無機碳利用途徑［15］。

雖然關于大型海藻無機碳利用方面的研究在很多種類中已經(jīng)做得較為深入［16-17］，但對國內(nèi)金潮原因種銅藻的相關研究目前仍比較缺乏。藻類主要是通過主動運輸和／或被動跨膜擴散來吸收利用海水中的HCO-3和／或分子CO2，在這個過程中，藻體附近培養(yǎng)海水中的pH值會受到一定的影響。因此，可以通過測定密閉系統(tǒng)中海水pH值的變化（即pH漂移曲線）來衡量藻類的光合作用［18］。在光合作用測定時，TRIS緩沖液通常用于維持反應介質(zhì)的恒定pH值。然而，有研究表明，緩沖液本身有時也可能抑制某些大型藻類如糖海帶（Laminaria saccharina）、亨氏馬尾藻（Sargassum henslowianum）等的光合固碳［19-20］。因此，本研究以銅藻為研究對象，對比研究不同pH值、TRIS緩沖劑及不同碳利用抑制劑對其光合固碳速率的影響，并探討不同pH下的pH漂移曲線，以期揭示銅藻無機碳利用的基本特性，進而為銅藻金潮暴發(fā)機制的研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

銅藻采自山東省榮成市近海漂浮種群，采集海區(qū)表層海水溫度為18℃。采集之后將其放于低溫箱（5℃）中于2 h內(nèi)運回實驗室。采集回的銅藻用自然海水洗凈，選擇健康及大小一致的個體在實驗室內(nèi)用自然海水暫養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實驗。自然海水的鹽度為30，硝氮濃度為50.0 μmol·L-1，氨氮濃度為 0.3μmol·L-1，無機磷濃度為0.8μmol·L-1。暫養(yǎng)條件如下：溫度為18℃，光照強度為150μmol photons·m-2·s-1，光周期為L∶D＝12 h∶12 h，連續(xù)充氣速率為2 L·min-1。

1.2 光合固碳速率的測定

藻體光合固碳速率用光合放氧速率（μmol O2·h-1·g-1FW）來表示，采用氧電極法測定。氧電極反應杯的溫度通過低溫恒溫槽（NDC-0506，浙江納德科學儀器有限公司）控制，溫度為18℃。光源用碘鎢燈提供，光強為600μmol photons·m-2·s-1，通過調(diào)整鎢燈與反應杯的距離來獲取，并使用光量子計（QRT1，英國Hansatech公司）測定。測定放氧速率時，選取藻體的小葉片部位，剪成長度約為1 cm的片段，為降低機械損傷對光合作用的影響，片段先置于原培養(yǎng)條件下恢復培養(yǎng)約1 h。稱取0.15 g左右濕重的片段置于盛有8 mL無碳海水的反應杯內(nèi)，插入氧電極（Chlorolab 3，Hansatech，UK），使其和海水之間無任何氣泡。光照適應10 min左右來消耗掉藻體自身以及海水中的碳，當放氧速率為零時，藻體處于碳耗竭狀態(tài)。再向反應杯內(nèi)注入一定濃度的NaHCO3溶液作為銅藻的外源無機碳，待放氧速率穩(wěn)定后，記錄其單位時間內(nèi)的放氧量。

無碳海水的配制（現(xiàn)配現(xiàn)用）：向500 mL過濾滅菌海水中加入1∶1 HCl至pH小于4.0；通氮氣2 h以驅(qū)除海水中的CO2氣體；加入TRIS緩沖液使其終濃度為25 mmol·L-1；再使用濃度為1mmol·L-1的NaOH調(diào)節(jié) pH為8.0，密封備用。pH值測定使用pH計（PHS-3CW，上海理達儀器廠），使用前校準。

1.3 不同p H、緩沖劑、抑制劑處理

取500 mL過濾滅菌海水（無機碳濃度為2.2 mmol·L-1），加入TRIS緩沖液，對照組不加緩沖液，使其終濃度為 25 mmol·L-1，以 1∶1 HCl和 1 mmol·L-1NaOH分別調(diào)節(jié) pH為 6.5、8.0和9.5。稱取濕重為0.15 g左右的片段，置于氧電極反應杯中，加入不同pH的滅菌自然海水8 mL，插入氧電極，打開光源，適應5 min待放氧穩(wěn)定，待放氧速率穩(wěn)定后，記錄放氧速率。

稱取濕重為0.15 g左右的片段，置于氧電極反應杯中，加入不同pH的滅菌自然海水8 mL，插入氧電極，打開光源，適應5 min待放氧穩(wěn)定，加入碳酸酐酶抑制劑AZ、EZ及陰離子交換蛋白抑制劑 DIDS，AZ和 EZ終濃度為200μmol·L-1，DIDS的使用終濃度為300μmol·L-1，對照組中不加抑制劑。待放氧速率穩(wěn)定后，記錄放氧速率。抑制率的計算公式如下：

抑制率（%）＝（對照組放氧速率-含抑制劑組放氧速率）／對照組放氧速率×100。

1.4 光合作用-無機碳響應曲線（P-C曲線）的測定

用氧電極（Chlorolab 3，Hansatech，UK）測定藻體光合放氧速率。將無碳海水注入反應杯中，于18℃、600μmol photons·m-2·s-1光強下注入不同濃度的NaHCO3溶液。無機碳濃度梯度設置為0.137 5、0.275 0、0.550 0、1.100 0、2.200 0、4.400 0、8.800 0、13.200 0、17.600 0 mmol·L-1。當反應杯內(nèi)放氧速率為零時，測定光合放氧速率。得到光合放氧速率對無機碳濃度響應曲線（P-C曲線），用米氏方程對P-C曲線進行非線性擬合［21］：

其中，V為光合固碳速率，Vmax為最大光合固碳速率，S為反應介質(zhì)中總無機碳濃度，K0.5為達到最大光合固碳速率一半時對應的無機碳濃度，1／K0.5表示藻體對外源無機碳的親和力。

1.5 pH漂移曲線（pH-drift）及pH補償點的測定

稱取0.5 g左右鮮重藻體置于25 mL的透光玻璃管中，并加入20 mL滅菌海水。分為4組：對照組（不加抑制劑）、添加AZ組、添加EZ組、添加DIDS組。密封后在溫度為25℃、光強為150 μmol photons·m-2·s-1條件進行連續(xù)光照，每隔1 h測定培養(yǎng)海水的pH，直至pH值穩(wěn)定不變?yōu)橹?，此pH值即為pH補償點，所得曲線為pH漂移曲線（pH-drift）。光強通過光照培養(yǎng)箱（MGC-250P型，上海一恒科技有限公司）調(diào)節(jié)，pH測定使用pH計（PHS-3CW，上海理達儀器廠），使用前校準pH計。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗測定結(jié)果均表示為平均值±標準差（n≥3），數(shù)據(jù)運用 Excel和 SPSS來進行整理及統(tǒng)計分析，采用 origin 8.0（Origin，USA）作圖。對測定結(jié)果進行正態(tài)化數(shù)據(jù)檢驗，均為正態(tài)分布數(shù)據(jù)，選用單因素方差分析（One-way ANOVA，Duncan）對測定結(jié)果進行差異性分析，差異顯著性水平為 P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液TRIS對銅藻光合固碳的影響

對照組銅藻光合固碳速率在pH值為6.5、8.0、9.5時分別為（59.62±2.35）、（33.70±1.51）、（12.48±0.32）μmol O2·h-1·g-1FW。TRIS緩沖液處理組銅藻的光合固碳速率在pH值為 6.5、8.0、9.5時分別為（58.66±1.87）、（33.38±1.76）、（12.26±0.18）μmol O2·h-1·g-1FW。對照組與TRIS緩沖液處理組銅藻的光合固碳速率無顯著差異（P＞0.05，圖1），這一結(jié)果表明TRIS緩沖劑對銅藻的光合固碳速率無顯著影響。同一處理組中，對照組和TRIS處理組銅藻的光合固碳速率均隨著pH值的升高而下降，且在3種pH值處理組間光合固碳速率差異顯著（P＜0.05）。與對照組pH值6.5下的光合固碳速率相比，pH值升至8.0和9.5時，其光合固碳速率分別下降了43.47%和79.06%。

圖1 不同pH值下TRIS緩沖液對銅藻光合固碳速率的影響Fig.1 Effects of TRIS buffer on the photosynthetic carbon fixation rates of Sargassum horneri under different pH levels注：不同小寫字母表示數(shù)值之間存在顯著差異（P＜0.05）Note：Different lowercase letters indicate significant differences between values（P＜0.05）

2.2 抑制劑AZ、EZ及DIDS對銅藻光合固碳的影響

同一pH值下，與對照組相比，加入抑制劑AZ、EZ和DIDS均顯著抑制了銅藻的光合固碳速率（P＜0.05），且抑制率為 AZ＜EZ＜DIDS（圖2）。在pH值為6.5時，與對照組相比，加入AZ、EZ和DIDS分別使其光合固碳速率降低了7.32%、52.06%和 60.65%。在 pH值為 8.0時，加入AZ、EZ和DIDS分別使其光合固碳速率降低了10.44%、69.31%和77.86%。當 pH值進一步升至9.5時，加入AZ、EZ和DIDS分別使其光合固碳速率降低了25.64%、37.66%和57.29%。

圖2 不同pH值下抑制劑對銅藻光合固碳速率的影響Fig.2 Effects of inhibitors on the photosynthetic carbon fixation rates of Sargassum horneri under different p H levels注：不同大寫和小寫字母分別表示相同pH值下不同處理及不同pH下相同處理之間具有顯著差異（P＜0.05）Note：Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the same pH level and the same treatment at different pH levels（P＜0.05）

當pH值為6.5時，抑制劑 AZ、EZ和DIDS對銅藻光合固碳速率的抑制率分別為7.25%、52.03% 、60.65% ；當 pH值為 8.0時，上述 3種抑制劑的抑制率分別為10.27%、69.32%、77.84% ；而當pH值為9.5時，其抑制率分別為25.38%、37.64%、57.24%（圖 3）。可見在同一pH值下，抑制劑AZ、EZ和DIDS均顯著抑制了銅藻的光合固碳速率（P＜0.05）。在pH值為6.5和8.0時，AZ、EZ和 DIDS的抑制率存在顯著差異（P＜0.05）；在 pH值為9.5時，AZ和 EZ的抑制率無顯著差異（P＞0.05），但 AZ、EZ的抑制率均與DIDS存在顯著差異（P＜0.05）。同一抑制劑處理時，AZ的抑制率隨著pH的增加而增加，但在3種pH處理組間無顯著性差異（P＞0.05）。EZ和DIDS的抑制率隨著pH的增加先增加后減少，且均在pH值8.0時達到最大抑制率，且3種pH值下的抑制率存在顯著性差異（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同p H值下3種抑制劑對銅藻光合固碳速率的抑制率Fig.3 Inhibition ratio of three inhibitors on the photosynthetic carbon fixation rates of Sargassum horneri under different pH levels注：不同大寫和小寫字母分別表示相同pH值下不同處理及不同pH值下相同處理之間具有顯著差異（P＜0.05）Note：Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the same pH level and the same treatment at different pH levels（P＜0.05）

2.3 不同p H值下銅藻光合固碳對無機碳（Ci）濃度的響應

銅藻的光合固碳速率在各pH值條件下均隨著外源無機碳濃度的升高而升高，并漸趨飽和（圖4）。在pH值為6.5時，其光合放氧速率在無機碳濃度為2.2 mmol·L-1時達到飽和；在pH值8.0和9.5時，其光合放氧速率均在無機碳濃度為 8.8 mmol·L-1時達到飽和。在 pH值為6.5、8.0、9.5時，銅藻的最大光合固碳速率（Vmax）分別為（88.24±4.36）、（82.85±4.86）、（61.78±2.98）μmol O2·h-1·g-1FW；Vmax在 pH值為6.5和8.0時差異不顯著（P＞0.05），但兩者均與pH值9.5的 Vmax有顯著性差異（P＜0.05，表1）。光合固碳表觀半飽和常數(shù) K0.5（DIC）是用來表示細胞光合作用對外源無機碳的親和力，K0.5（DIC）越小，親和力越大，即細胞達到最大光合固碳速率需要外源無機碳濃度越小。銅藻光合固碳的半飽和常數(shù) K0.5（DIC）隨著 pH的增大而增大，在 pH值為6.5、8.0、9.5時分別為（1.31±0.25）、（1.61±0.35）、（1.91±0.33）mmol·L-1（表 1）。與 pH值 6.5下的 K0.5（DIC）相比，pH值升至 8.0、9.5時，其 K0.5（DIC）升高了 22.90%和 45.80%。

圖4 不同p H值下銅藻光合固碳速率對無機碳升高的響應Fig.4 Responses of photosynthetic carbon fixation rate of Sargassum horneri to inorganic carbon concentration changes under different p H levels

2.4 不同pH值下銅藻的pH漂移曲線及p H補償點

添加銅藻的各密閉系統(tǒng)中海水的pH值隨著照射時間的增加而升高，并在6 h趨于穩(wěn)定（圖5）。在對照組中，海水的pH值穩(wěn)定在9.0；加入抑制劑AZ和EZ的處理，海水的pH值分別穩(wěn)定在8.89和8.66；而加入抑制劑 DIDS的處理，海水pH值穩(wěn)定在8.56。在同一時間下，銅藻的pH值補償點大小依次為：對照組＞AZ＞EZ＞DIDS。

3 討論

圖5 不同抑制劑對銅藻pH漂移曲線的影響Fig.5 Effects of different inhibitors on pH-drift curves of Sargassum horneri

本研究中，銅藻的光合放氧速率未受pH緩沖劑TRIS的影響（圖1），這與之前報道的石莼、紫菜［19］、龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）［22］和海黍子（Sargassum muticum）［17］的研究結(jié)果類似。因此，本研究在調(diào)節(jié)pH時選用TRIS緩沖劑。有研究表明，海水中游離的CO2濃度會隨著pH值的改變而改變［23］，且海水的pH值與游離CO2濃度呈反比，即 pH值升高，游離 CO2濃度則下降［24］，有報道稱，CO2濃度升高和 pH值降低能提高龍須菜吸收CO2占總無機碳利用的比例［25］。在海水 pH值從6.5上升到 8.0再上升到9.5的過程中，海水中游離的CO2濃度從1 000 μmol·L-1降低到 15μmol·L-1再降到接近 0 μmol·L-1［23］。本研究中，pH值由 8.0降至6.5，CO2的濃度升高，銅藻的光合放氧速率顯著升高（圖2）；而 pH值由 8.0升到 9.5，CO2的濃度降低，銅藻的光合放氧速率顯著下降（圖2）。表明銅藻對CO2有相當高的親和力，進行光合固碳過程中能夠直接利用海水中游離的CO2。另一方面，pH值大于8.0的海水中，外源無機碳存在的形式為HCO-3，本研究中銅藻仍然可以進行光合固碳，并且光合固碳速率隨著無機碳濃度的升高而升高（圖4），進一步表明高pH條件下，銅藻可以利用海水中的HCO-3來進行光合固碳，這與在海帶目（Laminariales）中的研究結(jié)果類似［26］。

表1 不同pH值下銅藻的最大光合固碳速率（V max）和半飽常數(shù)（K0.5）Tab.1 Carbon-saturating maximum photosynthetic carbon fixation rate（V max）and half saturation constant（K0.5）of Sargassum horneri under different pH levels

碳酸酐酶（CA）由于其分布位置不同，分為胞外碳酸酐酶（periplasmic CA，pCA）和胞內(nèi)碳酸酐酶［27］。添加碳酸酐酶抑制劑AZ、EZ及陰離子交換蛋白抑制劑DIDS都使得銅藻的光合固碳速率和pH補償點顯著降低（圖2，圖5）。這是因為碳酸酐酶對藻類吸收利用HCO-3極其重要［24］，碳酸酐酶的作用是將HCO-3快速轉(zhuǎn)化成CO2以此來供應光合固碳作用［27］。AZ為胞外碳酸酐酶抑制劑只抑制pCA的活性，pCA主要作用是催化藻體細胞表面的HCO-3轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2；EZ為總的碳酸酐酶抑制劑，能夠同時抑制胞內(nèi)和胞外CA兩者的活性［28］。本研究中，加入碳酸酐酶抑制劑AZ抑制了pCA活性，細胞表面的HCO-3轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2這一過程受到抑制，導致進入細胞內(nèi)的無機碳量減少，而加入EZ同時抑制胞內(nèi)和胞外CA兩者的活性，導致藻體整體的光合固碳速率降低。因此，抑制作用EZ顯著大于AZ（圖3）。證實了銅藻可以通過pCA把HCO-3催化為CO2后再吸收利用。這一現(xiàn)象在海帶、海黍子、壇紫菜中也存在［16-17，29］。

除此之外，陰離子交換蛋白酶也可以直接作用HCO-3使其轉(zhuǎn)化為藻類的無機碳源，而DIDS抑制了陰離子交換蛋白酶的活性，從而抑制無機碳的利用［30］，本研究中銅藻的光合固碳速率顯著下降。同時，與胞外碳酸酐酶催化HCO-3相比，陰離子交換蛋白直接吸收 HCO-3的效率更高［31］。有報道稱，掌狀紅皮藻（Palmaria palmate）在自然海水中主要通過pCA吸收外源無機碳，但當藻體處于高pH碳限制環(huán)境一段時間后，藻體將主要通過陰離子交換蛋白酶直接吸收HCO-3［32］，因環(huán)境pH的差異導致藻體無機碳的利用機制有所不同［33-34］。有研究報道，海帶、海黍子等大型海藻中陰離子交換蛋白抑制劑DIDS在高pH條件下具有較高抑制率［16-17］。該結(jié)論在本研究中也得到了證實，pH值為9.5時DIDS的抑制率最高（圖4）。這也表明銅藻存在高效的HCO-3直接吸收方式。

藻體在密閉系統(tǒng)進行光合作用會消耗海水中的CO2，導致CO2濃度下降，海水pH升高。因此，也可以用pH補償點的變化來探究藻體無機碳的利用［20］。有研究表明，密閉系統(tǒng)進行的pH漂移實驗中，那些能夠利用培養(yǎng)液中HCO-3的藻類 pH補償點通常大于 9.0［35-36］。本研究中，經(jīng)過一段時間后，培養(yǎng)銅藻的海水pH值最終穩(wěn)定在9.0左右（圖5）。與此同時，3種抑制劑都導致了銅藻的pH補償點下降，進一步證明銅藻在進行光合固碳過程中可以直接吸收利用HCO-3。這一方式是大型海藻無機碳利用的重要途徑［37］。

4 小結(jié)

本研究顯示，我國近海金潮原因藻銅藻的光合固碳速率隨著pH值的升高而降低，TRIS緩沖液對銅藻光合固碳速率無顯著影響；3種抑制劑AZ、EA和DIDS顯著抑制了銅藻光合固碳速率，且抑制率排序為DIDS＞EZ＞AZ；與此同時，銅藻在光合固碳進程中，既可以利用海水中游離的CO2，也可以直接利用陰離子交換蛋白吸收HCO-3，還可以利用胞外碳酸酐酶把HCO-3催化為CO2再進行吸收利用。銅藻光合固碳過程中存在的多種無機碳利用方式可使其在斷裂漂浮后迅速吸收海水中的外源無機碳用于快速生長，最終可能導致銅藻金潮的暴發(fā)。