李 浩，孟德龍，薛寶寶，牛東紅，李家樂，沈和定

（上海海洋大學，省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

α-淀粉酶（Alpha amylase）廣泛存在于動物、植物和微生物中，主要參與葡萄糖高分子聚合物中α-1，4-糖苷鍵水解以及作用于淀粉生成糊精和還原糖等反應(yīng)，對動植物及微生物體內(nèi)的淀粉降解起重要作用［1］。α-淀粉酶基因廣泛存在于真核生物和原核生物基因組中［2-5］，到目前為止，許多物種的該基因序列已經(jīng)被成功克隆。如：YANG等［6］、TADA等［7］、ROGERS等［8］、LEVY等［9］先后分別從細菌、真菌、植物、動物中克隆得到α-淀粉酶基因。在魚類中，已經(jīng)成功克隆出美洲擬鰈（Pseudopleuronectes americanus）［10］、澳洲肺魚（Neoceratodus forsteri）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）、斑馬魚（Danio rerio）、尖吻鱸（Lates calcarifer）［11］、 斑 點 綠 河 豚 （Tetraodon nigroviridis）［12］等 α-淀粉酶基因全長序列；此外，在貝類如大珠母貝（Pinctada maxima）［13］、合浦珠母貝（Pinctada fucata）［14］、長牡蠣（Crassostrea gigas）、九孔鮑（Haliotis diversicolor supertexta）［15］、河蜆（Corbicula fluminea）、歐洲大扇貝（Pecten maximus）等也已經(jīng)成功克隆出α-淀粉酶基因全長序列。隨著α-淀粉酶基因克隆與結(jié)構(gòu)分析技術(shù)不斷成熟，關(guān)于α-淀粉酶基因與水產(chǎn)經(jīng)濟動物生長性狀相關(guān)性分析逐漸成為水產(chǎn)研究的熱點，如長牡蠣淀粉酶基因中1個SNP位點與體質(zhì)量顯著相關(guān)［16］；合浦珠母貝的 α-淀粉酶基因中發(fā)現(xiàn)7個SNP位點與生長性狀存在顯著性差異［14］；草魚（Ctenopharyngodon idellus）α-淀粉酶基因的2個SNP位點與生長性狀差異均不顯著［17］；九孔鮑α-淀粉酶基因中間片段比對獲得2個與生長性狀相關(guān) SNP位點［15］。但關(guān)于縊蟶（Sinonovacula constricta）a-淀粉酶基因與生長性狀相關(guān)SNP位點研究尚未見報道。

縊蟶，俗稱蟶子、蜻子，廣泛分布于中國、日本和朝鮮等國的沿海地區(qū)，埋棲生活，生長快，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有重要的經(jīng)濟價值［18］，是沿海灘涂養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟貝類。近年來，隨著縊蟶規(guī)模化養(yǎng)殖技術(shù)和模式的不斷創(chuàng)新和完善，對具有生長速度快、養(yǎng)殖周期短的縊蟶新品種需求越來越迫切。α-淀粉酶作為縊蟶體內(nèi)主要的消化酶，其活性與生長發(fā)育相關(guān)，較快的生長速度對應(yīng)較強的消化生理機能，高水平的消化酶活性有利于縊蟶對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收并轉(zhuǎn)化為生長發(fā)育所需的能量［19］，另有研究表明 α-淀粉酶基因多態(tài)性對貝類生長有重要影響［20-22］。因此本實驗以縊蟶快長新品種“申浙1號”為研究對象，采用PCR產(chǎn)物直接測序法對縊蟶α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域進行 SNPs位點篩選，利用MassARRAY質(zhì)譜檢測方法對其進行分型，將該基因的多態(tài)性與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與生長性狀相關(guān)的分子標記，為縊蟶遺傳改良特征標記篩選及定制培育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用本實驗室自2008年經(jīng)過連續(xù)5代選擇育種獲得的縊蟶快長新品種“申浙1號”群體作為親本，進行同批次人工育種且同塘養(yǎng)殖獲得8月齡縊蟶快長新品種“申浙1號”群體，隨機選取204個個體作為實驗材料，平均體質(zhì)量為（7.682±1.479）g（取自浙江省寧?？h潮漁水產(chǎn)養(yǎng)殖公司）。挑選6個極大個體［平均體質(zhì)量為（10.893±0.926）g］和 6個極小個體［平均體質(zhì)量為（5.086±0.532）g］，取外套膜置于 95%乙醇固定，4℃保存，用于提取DNA篩選SNP位點?？O蟶快長新品種“申浙1號”群體分別用游標卡尺（精確度0.01 mm）和電子天平（精確度 0.001 g）測量其殼長、殼高、殼寬、總重等生長數(shù)據(jù)用于進行生長性狀相關(guān)性分析，同時取外套膜置于95%乙醇固定，4℃保存，提取DNA用于SNP分型。

實驗所用引物委托上海生工生物工程有限公司合成；海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR master mix、DNA分子量標準購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 基因組DNA提取

縊蟶外套膜基因組DNA提取，按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒方法進行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，-20℃保存。

1.3 縊蟶α-淀粉酶內(nèi)含子克隆

根據(jù)GenBank中已登錄的縊蟶α-淀粉酶基因cDNA序列（KX197931.1）同時參照同源性最高的（71%）河蜆 α-淀粉酶基因組序列（AF468016.2），利用 Primer 5.0設(shè)計特異性引物AMY F1／AMY R1、AMY F2／AMY R2、AMY F3／AMY R3、AMY F4／AMY R4（表 1）對縊蟶 α-淀粉酶基因內(nèi)含子區(qū)域進行擴增，PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR master mix 10μL，上下游引物（10 μM）各 0.6μL，DNA模版 0.8μL，加 ddH2O補足20μL。PCR擴增程序為：94℃ 5 min，94℃30 s，50℃ 30 s／60℃ 30 s／60℃ 30 s／50℃ 30s，72℃1～3 min，35個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，然后按照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書進行純化，將回收的產(chǎn)物與pMD18-LT載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，菌落PCR篩選陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 縊蟶α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域SNPs位點篩選

根據(jù)真核生物基因GT-AG法則，將1.3中獲得的測序結(jié)果進行連接，獲得縊蟶α-L淀粉酶全基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計特異性引物AMY F5／AMY R5、AMY F6／AMY R6、AMY F7／AMY R7、AMY F8／AMY R8、AMY F9／AMY R9、AMY F10／AMY R10（表 1）分別對縊蟶 α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域進行擴增。PCR反應(yīng)體系同縊蟶α-淀粉酶內(nèi)含子克隆的反應(yīng)體系，6對引物PCR擴增程序為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，48.5℃ 30 s／52℃ 30 s／54℃ 30 s／50℃ 30 s／53.3℃ 30 s／50℃ 30 s，72℃ 1～2 min，35個循環(huán)；72℃10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，然后PCR產(chǎn)物切膠回收純化，送上海生工生物工程有限公司直接進行 PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果用軟件DNAMAN進行比對，發(fā)現(xiàn) SNP位點后，用SnapShot軟件查看測序圖譜，進行人工校對，原則為：1）突變位點在所有比對序列中出現(xiàn)頻率≥20%則認為是一個潛在的SNP位點。2）突變位點只出現(xiàn)一次則認為是測序錯誤所致故而舍棄。3）測序結(jié)果在引物3′端后的40個堿基內(nèi)出現(xiàn)的突變位點不予考慮。

1.5 SNP位點分型

由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司采用MassARRAY質(zhì)譜檢測方法對篩選出來的SNP位點進行分型，具體方法為根據(jù)篩選出的位點進行PCR引物和延伸引物設(shè)計，PCR引物用于擴增待驗SNP位點的目的片段，延伸引物用于延伸待驗SNP堿基。SNP分型具體操作為：第一步，PCR擴增目的片段，擴增體系為：HotStar Taq（5U·μL-1）0.100μL，MgCl2（25 mM）0.325μL，PCR Buffer（15 mM MgCl2）0.625μL，dNTP Mix（25 mM each）0.100μL，Primer Mix（500 nM each）1.000μL，加 Water（HPLC grade）補足4.000μL。擴增條件為94℃ 5 min，94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃1 min，45個循環(huán)，72℃3 min。第二步，用SAP處理 PCR產(chǎn)物，SAP Mix處理液體系為10xSAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme（1U·μL-1）0.30μL，加 Water（HPLC grade）補足 2.00μL。SAP反應(yīng)程序為37℃20 min，85℃5 min，4℃保存。第三步，SNP位點延伸，iPLEX Termination mix 0.200μL，iPLEX Enzyme 0.041μL，0.222×iPLEX Buffer Plus 0.200μL，Primer Mix 0.940 μL，加 Water（HPLC grade）補足 2μL。然后加入上述反應(yīng)液，混均。延伸反應(yīng)程序為94℃30 s，94℃ 5 s，（52℃ 5 s，80℃5 s，5個循環(huán)），40個循環(huán)，72℃3 min，4℃保存。第四步，對延伸產(chǎn)物進行樹脂純化，運用MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀將其點樣至 SpectroCHIP芯片，MassARRAY Analyzer Compac質(zhì)譜檢測，TYPER軟件分析實驗結(jié)果，從而獲得分型數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

SNPs分型與縊蟶快長新品種“申浙1號”表型數(shù)據(jù)利用EXCEL軟件進行整理，使用Cervus 3.0軟件［23］進行分型后SNP位點遺傳多樣性參數(shù)計算，運用 SPSS 22.0［24］軟件中的一般線性模型對縊蟶快長新品種“申浙1號”進行位點（單倍型）與殼長、殼高、殼寬和總重的關(guān)聯(lián)分析，若組間存在顯著性差異時，進行Duncan’s氏法的事后多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 縊蟶α-淀粉酶基因序列獲得

縊蟶α-淀粉酶基因序列總長度為5 767 bp，含有7個外顯子和6個內(nèi)含子，剪切符合GTLAG剪接規(guī)則，其中4號外顯子最長，為1 094 bp，1號外顯子最短，為36 bp，其余長度在137～244 bp之間；6號內(nèi)含子最長，為1 255 bp，2號內(nèi)含子最短，為419 bp，其余長度在433～595 bp之間。

2.2 縊蟶α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域突變位點篩查

縊蟶α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域進行擴增、測序和比對，共發(fā)現(xiàn)18個候選SNPs位點，以縊蟶α-淀粉酶 cDNA序列（KX197931.1）起始密碼ATG開始，分別命名為 Rs-1：48 G／C、Rs-2：247 C／A、Rs-3：420 A／G、Rs-4：441C／T、Rs-5：537 G／T、Rs-6：837 G／T、Rs-7：936 A／G、Rs-8：952A／C、Rs-9：1047 T／G、Rs-10：1062 C／T、Rs-11：1287C／T、Rs-12：1350 A／C、Rs-13：1362 C／T、Rs-14：1371 C／T、Rs-15：1503T／C、Rs-16：1536 T／C、Rs-17：1737T／C、Rs-18：1788 C／T。

表1 α-淀粉酶基因序列獲得及外顯子區(qū)域SNP位點篩選所用引物Tab.1 Primers used forα-amylase gene clone and SNP test of exome

2.3 α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域SNPs位點遺傳參數(shù)分析

SNP位點分型前技術(shù)評估，Rs-4、Rs-15、Rs-17 3個位點不能設(shè)計引物進行檢測，故未對其進行SNP位點分型。運用MassARRAY質(zhì)譜檢測方法對縊蟶快長新品種“申浙1號”204個個體進行α-淀粉酶外顯子區(qū)域15個SNPs位點分型結(jié)果顯示，Rs-8、Rs-11兩個位點呈現(xiàn)三態(tài)，其余位點均呈現(xiàn)為二態(tài)。由于3個或者4個等位多態(tài)性極為少見，幾乎可以忽略［25］，因此本文中對 Rs-8、Rs-11位點未進行遺傳參數(shù)等相關(guān)計算。剩余位點采用Cervus 3.0軟件計算其有效基因（Ne）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）及哈迪-溫伯格平衡（P-value）等遺傳參數(shù)（表 2，表 3）。

2.4 不同位點基因型與生長性狀的相關(guān)性分析

縊蟶快長新品種“申浙1號”群體不同位點的基因型與生長性狀的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rs-5、Rs-10位點各基因型個體之間部分生長性狀存在顯著性差異，其余位點未發(fā)現(xiàn)顯著性差異的存在（表4）。Rs-5位點顯著性差異在殼高與殼寬兩個性狀上表現(xiàn)具有一致性，均為GG型個體大于GT與 TT型個體（P＜0.05）；Rs-10位點 CC與CT型個體（殼長）均大于TT型個體（P＜0.05）。

表2 α-淀粉酶外顯子區(qū)域13個SNP位點的遺傳參數(shù)Tab.2 Polymorphic parameters of thirteen SNPs site ofα-amylase exon region

表3 α-淀粉酶外顯子區(qū)域SNPs位點的基因型及等位基因頻率Tab.3 Genotype and gene frequency of the SNPs site ofα-amylase exon region

在將13個SNP位點組合成雙倍型時，縊蟶快長新品種“申浙1號”204個個體共構(gòu)成31種類型，對其中頻率較高（大于3%）的組合（基因型與組合信息見表5），進行其與生長性狀的相關(guān)性分析（表6）。S1～S7在殼長、殼寬性狀方面均未達到顯著性水平；雙倍型S6殼高高于S3、S5、S7（P＜0.05）；雙倍型 S6總重高于 S7（P＜0.05）。

3 討論

3.1 縊蟶α-淀粉酶基因的多態(tài)性

SNP分為基因編碼區(qū)SNP和非編碼區(qū)SNP，據(jù)生物遺傳性狀影響可將基因編碼區(qū)SNP分為同義 cSNP（synonymous cSNP））和非同義 cSNP（non-synonymous cSNP））；發(fā)生在基因序列中非編碼區(qū)SNP以及編碼區(qū)同義cSNP一般不會對蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)和表型性狀產(chǎn)生重大影響。本實驗中絕大部分SNPs位點為同義突變，僅Rs-2、Rs-5、Rs-6 3個SNP位點發(fā)生非同義突變，分別為亮氨酸→異亮氨酸、天冬氨酸→谷氨酸、苯丙氨酸→亮氨酸。非同義cSNP的產(chǎn)生將會使藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而可能影響蛋白質(zhì)的功能，導致生物性狀的改變［26］。因此探究基因編碼區(qū)域SNP位點在生物育種領(lǐng)域的研究具有重要意義。本實驗對縊蟶快長新品種“申浙1號”α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域PCR產(chǎn)物直接測序、篩選獲得18個候選SNPs位點，分別有：Rs-1：48 G／C、Rs-2：247 C／A、Rs-3：420 A／G、Rs-5：537 G／T、Rs-6：837 G／T、Rs-7：936 A／G、Rs-9：1047 T／G、Rs-10：1062 C／T、Rs-12：1350 A／C、Rs-13：1362 C／T、Rs-14：1371 C／T、Rs-16：1536 T／C、Rs-18：1788 C／T；除3個位點無法進行SNPs分型外，剩余15個位點中2個位點為三態(tài)性，13個位點為二態(tài)性。深入研究13個SNPs位點，發(fā)現(xiàn)其變異類型為單個堿基的轉(zhuǎn)化或顛換，其比值接近于1，這一結(jié)果與合浦珠母貝［14］、九孔鮑［15］的 α-淀粉酶基因中兩種變異類型的比值一致。轉(zhuǎn)化中以C-T之間變異居多，這可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基大多數(shù)是甲基化，自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶所致［27］。

表4 α-淀粉酶外顯子區(qū)域SNP位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Correlation ofα-amylase exon region genotypes with growth traits

表5 雙倍型S1-S7基因型與組合信息Tab.5 Sequence information of diplotype S1-S7

表6 α-淀粉酶外顯子區(qū)域不同雙倍型與生長性狀的多重比較Tab.6 Association ofα-amylase exon region of different diplotypes with growth traits

另外，非同義突變雖未引起α-淀粉酶空間結(jié)構(gòu)改變，但對3個非同義突變位點不同基因型個體間的生長性狀差異性分析發(fā)現(xiàn)：Rs-2與Rs-6位點的突變對縊蟶快長新品種“申浙1號”群體生長性狀未造成顯著性差異（P＞0.05）；Rs-5位點由T→G，GG型個體的均值在平均殼高、平均殼寬兩個性狀方面均顯著大于TT與GT型（P＜0.05）。這可能因為Rs-5位點的突變位于α-淀粉酶基因的活性區(qū)域，突變造成酶活性提高。高水平的淀粉酶活性有利于縊蟶對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收并轉(zhuǎn)化為生長發(fā)育所需的能量［19］，因此在縊蟶快長新品種“申浙1號”育種過程中，針對Rs-5位點可以保留GG型個體，淘汰TT與GT型個體。

遺傳多樣性指物種群體內(nèi)及群體間的遺傳變異度，這種變異度決定其進化潛力［28］，豐富的遺傳多樣性意味著較高的環(huán)境適應(yīng)能力［29-30］，物種遺傳多樣性通常根據(jù)PIC、雜合度以及有效等位基因數(shù)等指標進行衡量。本實驗結(jié)果顯示，期望雜合度與觀測雜合度均小于0.5，表明α-淀粉酶基因外顯子區(qū)域較保守，選擇的潛力較小。一般認為PIC＞0.5時該位點為高度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)，PIC＜0.25則為低態(tài)［31］，13個 SNPs位點中有8個位點 PIC大于0.25，屬于中度多態(tài)性，其余均小于0.25，為低態(tài)性，PIC總體均值為0.237，為低態(tài)性。選擇潛力小以及PIC低態(tài)性表明：在連續(xù)數(shù)代的縊蟶群體選育過程中，基因型純合度提高，遺傳多樣性降低，表明快長選育效果理想。因此，在今后縊蟶選育中可以適當引進不同地理種群或者大幅提升親本數(shù)量以及建立性狀明顯的特征家系，以此來提高基因位點的豐富度，降低快長性狀退化消失的風險。

3.2 縊蟶α-淀粉酶外顯子區(qū)域SNPs位點與生長性狀關(guān)聯(lián)的應(yīng)用潛力

HUVET等［22］對太平洋牡蠣 α-淀粉酶基因多態(tài)性與生長性狀、消化特性的相關(guān)性進行研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型對牡蠣的攝食及吸收效率有顯著影響，進而影響牡蠣的生長。PRUDENCE等［16］對太平洋牡蠣α-淀粉酶基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)不同基因型牡蠣的生長差異顯著，并認為淀粉酶基因標記在選擇育種中具有潛在的價值。本實驗中縊蟶快長新品種“申浙1號”α-淀粉酶外顯子區(qū)域13個SNPs位點與生長性狀相關(guān)性分析顯示：只有Rs-5、Rs-10兩個單個位點在部分性狀（殼高、殼寬、殼長）存在顯著性差異，其余位點未發(fā)現(xiàn)與生長性狀的顯著性關(guān)聯(lián)，不同的突變位點對應(yīng)著各自的優(yōu)勢基因，但是生長性狀為連續(xù)的數(shù)量性狀，不是由某個優(yōu)勢基因所決定，單倍型分析則針對位于同一條染色體上的2個或多個SNPs的等位基因，根據(jù)所有連鎖不平衡的信息，探究多個突變位點間的相互作用，因此更加容易發(fā)現(xiàn)不同基因型組合方式對生長性狀帶來的影響［32-35］，也能更真實地反映位點與性狀的相關(guān)性［36］。本研究單倍型分析中發(fā)現(xiàn)：除殼長未有顯著性差異外，殼高、殼寬和總重3個性狀均存在顯著性差異，并且雙倍型S6在殼高、殼寬、總重3個性狀上均顯著大于S7（P＜0.05）。因此在今后縊蟶的分子育種過程中，應(yīng)盡量選擇生長優(yōu)勢明顯的雙倍型S6個體，淘汰基因型為雙倍型S7的個體。