高慧玲 劉寶玲 高宇 張飛 薛金愛 李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

杜氏鹽藻（Dunaliellasalina），是一種嗜鹽的單細(xì)胞真核藻類，屬于綠藻門、團(tuán)藻目、鹽藻科、鹽藻屬，為綠色單細(xì)胞的浮游植物。鹽藻細(xì)胞沒有纖維質(zhì)的細(xì)胞壁，細(xì)胞體形微小，長(zhǎng)約為14-22 μm，寬3-14 μm，有橢圓、卵圓和長(zhǎng)頸瓶等不同形態(tài)［1］。杜氏鹽藻能在高鹽（22%-30% NaCl）條件下生長(zhǎng)，生活條件不良時(shí)鹽藻細(xì)胞會(huì)大量合成β-胡蘿卜素和血紅素，藻體呈紅色，會(huì)把湖水染成紅色或粉紅色［2］。鹽藻很容易規(guī)?；囵B(yǎng)，能夠作為生物反應(yīng)器表達(dá)一些重要的基因而合成積累目標(biāo)化合物［3-4］。杜氏鹽藻含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)和β-胡蘿卜素等［5］，在食品、醫(yī)藥保健以及化工等產(chǎn)業(yè)中具有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值。尤其是鹽藻細(xì)胞油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的39%-44%［6］，集約化養(yǎng)殖可聯(lián)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)食用油脂或生物柴油［7-8］，具有不與人爭(zhēng)地、爭(zhēng)糧的優(yōu)勢(shì)［9-10］。鑒于杜氏鹽藻含油量高、且含有較多的油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸，鹽藻被認(rèn)為是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)食用油或工業(yè)用油脂的天然生物原料之一［11］。因此，研究鹽藻細(xì)胞油脂合成積累及調(diào)控機(jī)制有助于富油鹽藻株系的培育及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

β-酮脂酰 -ACP合酶III（β-ketoacyl-ACP synthase III，KASIII）催化乙酰 -CoA（acetyl-CoA）（2C）與丙二酰-ACP（malonyl-ACP）（3C）縮合生成乙酰乙酰-ACP（acetoacetyl-ACP）（4C）進(jìn)入碳鏈延伸循環(huán)。乙酰乙酰-ACP經(jīng)第一次還原、脫水、第二次還原反應(yīng)生成丁酰-ACP（butyryl-ACP）（4C）。丁酰-ACP再次經(jīng)縮合-還原-脫水-再還原循環(huán)延長(zhǎng)碳鏈，每次循環(huán)添加2個(gè)C原子，直至14或16C。KASIII作為啟動(dòng)質(zhì)體中脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶之一，在植物油脂合成代謝途徑中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，在植物體內(nèi)，KASIII的活性影響脂肪酸合成速率，并且受到脂酰鏈延伸終產(chǎn)物（酯酰-ACP）的反饋抑制［12］。KASIII活性強(qiáng)弱決定著脂肪酸碳鏈的延伸長(zhǎng)度。例如，在萼距花（Cuphea hookeriana）種子中，KASIII活性受到癸酰-ACP的抑制可產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的脂肪酸［13］。在煙草（Nicotiana tabacum）中，過(guò)表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea）KASIII基因，棕櫚酸（C16：0）含量明顯增加［14］。將乳酸乳球菌KSAIII活性位點(diǎn)突變后，乳酸乳球菌不能在缺乏長(zhǎng)鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，這表明KASIII也是細(xì)菌脂肪酸合成必需的關(guān)鍵酶［15］。

近年來(lái)，人們相繼研究了油桐（Vernicia fordii）［16］、麻風(fēng)樹（Jatropha carcas）［17］和向日葵（Helianthus annuus）［18］等植物的KASIII基因及其功能。Du等［19］于2018年發(fā)現(xiàn)亞洲棉（Gossypium arboreum）GaKASIII酶保守域中氨基酸的改變能決定合成脂肪酸的種類。例如，在ACP_synthase_III_C結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸（TGT）被精氨酸（CGT）取代，結(jié)果導(dǎo)致原先不生成棕櫚油酸（C16：1）的種子大量合成并積累了C16：1［19］。杜氏鹽藻作為一種重要的單細(xì)胞經(jīng)濟(jì)藻種，含有豐富的脂肪酸（如棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等），然而還未見其KASIII基因和蛋白特征及功能的報(bào)道。為此，本文分離鑒定杜氏鹽藻的DsKASIII基因，并系統(tǒng)分析其編碼酶蛋白的理化特性和亞細(xì)胞定位及功能預(yù)測(cè)。重點(diǎn)檢測(cè)氮脅迫條件下KASIII基因的表達(dá)譜及對(duì)藻細(xì)胞油脂和β-胡蘿卜素合成積累的影響，以期為進(jìn)一步全面解析鹽藻油脂和β-胡蘿卜素合成機(jī)制和建立鹽藻規(guī)模化養(yǎng)殖富集油脂的調(diào)控技術(shù)提供新的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）藻株SXAU-DS-01來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)能源微藻種質(zhì)庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 取樣 正常培養(yǎng)采用DM培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為6 000 lx，光暗比為12 h：12 h。將正常培養(yǎng)生長(zhǎng)的杜氏鹽藻培養(yǎng)到8 d后，離心（8 000 r/min，3 min）收集藻體沉淀，經(jīng)無(wú)菌水清洗后，一部分懸浮在缺1/2氮的DM培養(yǎng)基中，一部分懸浮于正常的（氮充足）DM培養(yǎng)基中，分別在培養(yǎng)1 d、3 d、6 d和9 d時(shí)，離心收集藻樣，經(jīng)液氮速凍后存于-80冰箱備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 從Phytozome v12.1數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中查找杜氏鹽藻的全基因組數(shù)據(jù)，并鑒定確認(rèn)DsKASIII基因的完整序列（Dusal.0826s00002.1）［20］。用 Vector NTI軟件對(duì)DsKASIII基因編碼序列設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的特異性引物（表1中DsKASIII引物），并由TSINGKE 生物技術(shù)公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的qRT-PCR引物

1.2.3 杜氏鹽藻總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采用ABM公司的RNA試劑盒提取藻樣的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及其純度檢測(cè)后，將其反轉(zhuǎn)錄成為cDNA 20 μL。 反轉(zhuǎn)錄體系為 ：AccuRT Reaction Stopper（5X）2 μL，5X All-In-One RT MasterMix 4 μL，RNA模板 1 μg，用 Nuclease-free H2O 補(bǔ)足到 20 μL。

1.2.4DsKASIII基因的克隆 以反轉(zhuǎn)錄得到的杜氏鹽藻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL擴(kuò)增體系包括：2 μL cDNA，0.4 μL正向引物與反向引物（表1 中 DsKASIII引 物，10 nmol/L），10 μL 2×Easypfu PCR SuperMix，7.2 μL Nuclease-free H2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收目標(biāo)PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到pEASY?-Blunt Zero-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，送至公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 杜氏鹽藻DsKASIII的序列分析

1.2.5.1 杜氏鹽藻DsKASIII編碼蛋白理化特性分析 利 用 在 線 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）對(duì)DsKASIII進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)（Intron-exon）分析，依據(jù)保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved Domain Database，CDD）（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/）鑒定DsKASIII蛋白的保守域。通過(guò)ExPasy網(wǎng)站的ProtParam 工 具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析DsKASIII蛋白的理化性質(zhì)。應(yīng)用Target P 1.1 Server（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/）預(yù)測(cè)DsKASIII蛋白的亞細(xì)胞定位。依據(jù)TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/） 工 具分析DsKASIII蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)。運(yùn)用SOPMA（http：//metadatabase.org/wiki/SOPMA） 和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預(yù)測(cè)DsKASIII的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5.2 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析 使用MEGA 6.06軟件對(duì)DsKASIII的氨基酸序列與其他14種不同植物的KASIII蛋白的氨基酸序列進(jìn)行ClustalW 多序列比對(duì)。這14種植物包括江南卷柏（XP_002984971.1）、小立碗蘚（XP_001754014.1）、深圳擬蘭（PKA66631.1）、油麥菜（PLY93166.1）、海棗（XP_008802619.1）、大豆（NP_001237735.1）、短 花 藥 野 生 稻（XP_006652901.2）、 小 球 藻（XP_005847747.1）、衣藻（GAX79646.1）、膠球藻（XP_005642863.1）、 念 珠 藻（WP_012406929.1）、鈍 頂 節(jié) 旋 藻（WP_006617507.1）、 萊 茵 衣 藻（PNW83774.1）、 團(tuán) 藻（XP_002951005.1）、 大 腸桿菌（NP_415609.1）。然后采用鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）構(gòu)建無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗(yàn)值設(shè)置1 000個(gè)循環(huán)，采用p-distance模式。

1.2.6 杜氏鹽藻DsKASIII基因在氮脅迫條件下的表達(dá)分析 取氮脅迫培養(yǎng)和正常培養(yǎng)不同時(shí)間的藻細(xì)胞樣品，分別制備cDNA。以各樣品cDNA為模板，采用熒光定量PCR分析DsKASIII基因的表達(dá)。PCR反 應(yīng) 體 系 為 ：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 10 μL，正向和反向引物各 0.6 μL，cDNA 1 μL，補(bǔ)加 7.8 μL的Nuclease-free H2O至總體積20 μL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCq法計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量數(shù)值，并通過(guò)Excel和SPASS分析數(shù)據(jù)后繪制柱狀圖。

1.2.7 杜氏鹽藻總脂肪酸提取及測(cè)定 利用氯仿-甲醇法提取正常培養(yǎng)與缺氮培養(yǎng)條件下的杜氏鹽藻的總脂。將杜氏鹽藻培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期（6 d），冷凍干燥得到藻粉。稱取100 mg的藻粉，加入3 mL甲醇：氯仿（2∶1）溶液，混勻4 000 r/min離心10 min。取上層有機(jī)相并加入0.8 mL的0.75%的NaCl溶液，振蕩15 min。下層樣品殘?jiān)屑尤? mL的氯仿溶液，混勻后4 000 r/min離心10 min。取上層有機(jī)相加入1 mL 0.75%的NaCl溶液，振蕩15 min。收集振蕩后的兩管溶液于一個(gè)試管，混勻，離心（4 000 r/min，10 min）后，吸取下清有機(jī)相至已稱重的新管中，55℃水浴蒸干后稱管重。每個(gè)樣品重復(fù)3次。計(jì)算方法：總脂含量=（加入樣品蒸干后的管重-加入樣品前的管重）/藻粉重

1.2.8 杜氏鹽藻β-胡蘿卜素的提取及測(cè)定 取10 mL藻液，4 000 r/min離心5 min。棄上清，在藻細(xì)胞沉淀中加入10 mL 80%丙酮溶液提取色素，萃取2-3次，至藻體呈灰白色。最后將萃取液定容到50 mL。用分光光度儀檢測(cè)萃取液在450 nm處的吸光值，根據(jù)Jensen［21］公式換算出β-胡蘿卜素含量。

β-胡 蘿 卜 素（mg/L）=（OD450× 稀 釋 倍數(shù) ×10×103）/2 500

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻DsKASIII基因的cDNA克隆與編碼蛋白理化特征分析

以杜氏鹽藻SX-DS-01藻株的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得DsKASIII基因完整的開放閱讀框（ORF），大小為960 bp（圖1），編碼319個(gè)氨基酸。DsKASIII基因DNA序列長(zhǎng)約16 kb，含有9個(gè)較短的外顯子和8個(gè)較長(zhǎng)的內(nèi)含子（圖2-B）。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，DsKASIII蛋白在107 aa和244 aa處分別含有活性位點(diǎn)和輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且含有眾多二聚體結(jié)合點(diǎn)。該蛋白具有KASIII家族的典型特征（圖2-A），以二聚體形式發(fā)揮催化功能。DsKASIII蛋白相對(duì)分子量為33.29 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.21。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，定位于質(zhì)體。

圖1 杜氏鹽藻KASIII基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

圖2 DsKASIII蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（A）和基因結(jié)構(gòu)（B）

2.2 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白的結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用TMHMM分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域顯示，DsKASIII蛋白中間部位（99-122 aa）和C末端（297-318 aa）在質(zhì)體內(nèi)膜上呈鑲嵌狀態(tài)。這種跨膜分布模式可能有助于該蛋白在催化脂肪酸合成過(guò)程從內(nèi)膜上獲取能量（圖3-A）。ProtScale分析DsKASIII蛋白疏水性/親水性的結(jié)果（圖3-B）表明，該蛋白的C末端（279-291 aa和296-315 aa）和中間部分（101-119 aa，127-137 aa）均存在明顯的疏水區(qū)，且位置大致和上述跨膜區(qū)相一致。這表明DsKASIII蛋白的中間區(qū)段可能主要結(jié)合并催化底物脂肪酰-ACP，而C末端可能負(fù)責(zé)將整個(gè)蛋白錨定在質(zhì)體內(nèi)膜上，對(duì)蛋白起一定的固定作用。

圖3 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域（A）和疏水結(jié)構(gòu)域（B）

預(yù)測(cè)的DsKASIII蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括ɑ-螺旋，β片層和無(wú)規(guī)則卷曲，分別為35.11%，25.71%和27.90%，而β-轉(zhuǎn)角較少，僅為11.29%（圖4-A）。通過(guò)用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的大腸桿菌（E. coli）KASIII蛋白結(jié)構(gòu)為模板（圖4-C），對(duì)DsKASIII蛋白進(jìn)行同源建模發(fā)現(xiàn)，DsKASIII以同源二聚體形式存在，且均勻?qū)ΨQ（圖4-B）。與E.coliKASIII不同，DsKASIII蛋白的外側(cè)不存在輔酶A配體。E.coliKASIII和DsKASIII蛋白序列相似度為41.54%。

2.3 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 杜氏鹽藻DsKASIII的二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（B）（注：C為大腸桿菌E.coli KASIII）

利用MEGA 6.06軟件對(duì)杜氏鹽藻以及14個(gè)來(lái)源于其他植物的KASIII蛋白序列進(jìn)行ClustalW 多序列比對(duì)（圖5）。DsKASIII與原核大腸桿菌KASIII僅具有38%的序列相似性，而與真核衣藻KASIII的序列相似性高達(dá)57%。DsKASIII蛋白在第107位置為半胱氨酸（Cys），是KAS酶在脂肪酸循環(huán)過(guò)程中的酰化位點(diǎn)。DsKASIII還含有兩個(gè)起催化作用的關(guān)鍵活性位點(diǎn)殘基His244和Asn275。圖5還顯示，KASIII蛋白在真核高等植物、微藻及細(xì)菌中的關(guān)鍵氨基酸（圖5紅色框標(biāo)注）是完全相同的，這表明盡管不同物種的KASIII蛋白序列差異較大，但在重要功能區(qū)，關(guān)鍵氨基酸則是高度保守的。這些位點(diǎn)在脂肪酸從頭合成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

采用鄰接法（N-J法）對(duì)各物種KASIII蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖6）表明，杜氏鹽藻DsKASIII蛋白與其他微藻的KASIII蛋白聚為一組，明顯區(qū)別于高等植物組和原核組。盡管各物種KASIII可行使相同的功能，但在漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中，原核類、真核微藻和真核高等植物KASIII蛋白亦產(chǎn)生了一定的結(jié)構(gòu)和催化特性差異。在所檢測(cè)的微藻中，DsKASIII和衣藻CeKASIII的同源關(guān)系最近，可能二者在進(jìn)化過(guò)程中有著較近的祖先來(lái)源。

2.4 DsKASIII基因在氮脅迫條件下的表達(dá)分析

檢測(cè)杜氏鹽藻DsKASIII基因在正常培養(yǎng)（氮充足）與氮脅迫情況下的表達(dá)譜（圖7）顯示，在正常培養(yǎng)和氮脅迫培養(yǎng)條件下，DsKASIII基因的表達(dá)均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，但在氮脅迫培養(yǎng)條件下DsKASIII表達(dá)量顯著高于正常培養(yǎng)條件下的表達(dá)量。氮脅迫第3天時(shí)，DsKASIII表達(dá)量達(dá)峰值，比正常培養(yǎng)3 d的表達(dá)量提高了1.1倍。氮脅迫第3天DsKASIII表達(dá)量比第1天增加了72.94%。然而，DsKASIII在正常培養(yǎng)3 d的表達(dá)水平僅比1 d時(shí)提高了37.48%。氮脅迫培養(yǎng)第9天DsKASIII的表達(dá)量仍比正常培養(yǎng)第9天的表達(dá)量高1.39倍。總之，與正常培養(yǎng)相比，在氮脅迫培養(yǎng)前期，DsKASIII快速上調(diào)表達(dá)，培養(yǎng)后期表達(dá)量下降緩慢。

圖5 DsKASIII與其他物種KASIII的蛋白序列比對(duì)

2.5 氮脅迫對(duì)杜氏鹽藻總油脂和β-胡蘿卜素積累的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的正常培養(yǎng)與氮脅迫培養(yǎng)的杜氏鹽藻樣品測(cè)試藻細(xì)胞總油脂含量（圖8-A）顯示，與正常培養(yǎng)條件相比，氮脅迫培養(yǎng)的藻細(xì)胞總脂含量提高了49.05%。由圖8-B可知，氮脅迫能促進(jìn)杜氏鹽藻β-胡蘿卜素的合成，β-胡蘿卜素含量比正常培養(yǎng)藻細(xì)胞增加了33.20%。

3 討論

圖6 DsKASIII和其他物種KASIII蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 氮充足和氮脅迫培養(yǎng)條件下杜氏鹽藻DsKASIII基因的表達(dá)分析（A：半定量PCR；B：qRT-PCR）

杜氏鹽藻及富油微藻是一類優(yōu)異生物油脂資源［22］，因其高效固碳、生長(zhǎng)周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、容易大規(guī)模養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，正日益發(fā)展成為制備優(yōu)質(zhì)食用油脂及生物柴油等產(chǎn)業(yè)的原材料［23］。解析微藻油脂生物合成機(jī)制和建立提高微藻油脂積累的調(diào)控技術(shù)是微藻油脂商業(yè)化開發(fā)利用的關(guān)鍵任務(wù)之一。KASIII在脂肪酸合成第一步的縮合反應(yīng)中催化乙酰-CoA和丙二酰-ACP生成乙酰乙酰-ACP。不少研究認(rèn)為KASIII在脂肪酸生物合成起始反應(yīng)中行使重要功能，是細(xì)胞油脂合成積累的限速酶之一［24］。研究表明，細(xì)菌、真菌、真核藻類和多種植物的KASIII蛋白在結(jié)構(gòu)、作用底物及功能方面具有多樣性。

圖8 氮充足和氮脅迫培養(yǎng)條件下杜氏鹽藻總脂和β-胡蘿卜素的含量

本文分離鑒定了杜氏鹽藻的DsKASIII基因并獲得了杜氏鹽藻中編碼KASIII基因的cDNA序列全長(zhǎng)。杜氏鹽藻KASIII基因含有9個(gè)外顯子，開放閱讀框全長(zhǎng)為960 bp，編碼319個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為6.21，分子量為33.3kD。DsKASIII蛋白具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，定位于質(zhì)體且鑲嵌式錨定在葉綠體內(nèi)膜上。DsKASIII以同源二聚體形式行使催化脂肪酸合成起始縮合反應(yīng)的功能。DsKASIII蛋白與原核大腸桿菌EcKASIII蛋白不同，DsKASIII沒有輔酶A配體。E.coliKASIII和DsKASIII蛋白序列相似度為41.54%，遠(yuǎn)高于不同細(xì)菌KASIII之間的相似度，如單黃胞菌（Xanthomonas oryzae）KASIII與大腸桿菌KASIII序列相似度僅為23.3%［25］。顯然，不同物種之間KASIII蛋白序列差異性較大，其催化合成脂肪酸的方式和對(duì)底物的特異性結(jié)合也可能具有明顯的差異［26］。DsKASIII蛋白含有3個(gè)起催化作用的關(guān)鍵活性位點(diǎn)殘基Cys107，His244和Asn275。與DsKASIII這3個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)相一致的是，已有報(bào)道惡性瘧原蟲KASIII蛋白（PfKASIII）的催化中心也具有此類位點(diǎn)，分別為Cys159，His298和Asn328［27］，進(jìn)一步暗示這個(gè)基因編碼DsKASIII蛋白。

杜氏鹽藻DsKASIII基因在氮脅迫條件下第三天的表達(dá)量達(dá)到最高峰，比正常培養(yǎng)高1.1倍，表明氮脅迫明顯誘導(dǎo)DsKASIII基因的上調(diào)表達(dá)。與之相似的是，氮脅迫可顯著誘導(dǎo)杜氏鹽藻DsFAD2基因的上調(diào)表達(dá)［28］。這些油脂合成相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)勢(shì)必影響到藻細(xì)胞油脂的合成積累?？傊繙y(cè)定顯示，氮脅迫條件下杜氏鹽藻的總脂比對(duì)照提高了49.05%，且β-胡蘿卜素含量也比對(duì)照增加了33.20%，可能DsKASIII基因的上調(diào)表達(dá)也促進(jìn)了藻細(xì)胞油脂和β-胡蘿卜素含量的升高。姚杰利用半連續(xù)缺氮方式培養(yǎng)的杜氏鹽藻油脂含量比對(duì)照組提高了70.4%［29］。已有研究發(fā)現(xiàn)氮脅迫亦可誘導(dǎo)其他微藻大量合成積累油脂。例如，低氮（0.75g/L）培養(yǎng)的氮濃度下小球藻產(chǎn)油量明顯升高，為標(biāo)準(zhǔn)氮濃度（1.5g/L）培養(yǎng)的藻細(xì)胞油脂含量的1.4倍［30］。Hu等［31］證明氮脅迫使杜氏鹽藻細(xì)胞調(diào)整了N元素的代謝方向，葉綠素、蛋白等含氮化合物合成減少而糖含量增加，為脂類的合成積累提供了豐富的碳骨架，從而使油脂含量提高。這些研究結(jié)果表明，氮脅迫可顯著上調(diào)藻細(xì)胞油脂的合成積累。孫輝等人發(fā)現(xiàn)氮元素的缺乏對(duì)杜氏鹽藻合成β-胡蘿卜素有促進(jìn)作用［32］，葉綠素是含氮的光合色素，而β-胡蘿卜素是不含氮的色素。氮脅迫必然限制葉綠素的合成甚至降解。β-胡蘿卜素的及時(shí)合成積累，可防護(hù)質(zhì)體光合作用的進(jìn)行［33］。亦有研究指出，油脂代謝產(chǎn)物為β-胡蘿卜素的合成提供了起始原材料［32］，這也許是在氮脅迫下，隨著油脂合成升高，β-胡蘿卜素積累增多的部分原因。進(jìn)一步需要開展氮脅迫條件下杜氏鹽藻多組學(xué)聯(lián)合分析以期從分子水平上認(rèn)識(shí)脅迫相應(yīng)及代謝重構(gòu)的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

本文分離獲得了杜氏鹽藻的DsKASIII基因，并系統(tǒng)解析了該酶蛋白的理化特性和在氮脅迫條件下DsKASIII基因表達(dá)譜及其對(duì)油脂和胡蘿卜素積累的影響。杜氏鹽藻KASIII基因含有9個(gè)外顯子，ORF為960 bp，編碼319個(gè)氨基酸。DsKASIII具有KASIII酶蛋白家族典型結(jié)構(gòu)域，定位于葉綠體，以二聚體行使功能。缺氮脅迫誘導(dǎo)DsKASIII基因上調(diào)表達(dá)并促進(jìn)鹽藻細(xì)胞油脂和β-胡蘿卜素的合成積累。本研究為全面解析微藻油脂和β-胡蘿卜素合成調(diào)控機(jī)制以及后續(xù)應(yīng)用基因工程策略提高杜氏鹽藻目標(biāo)化合物的富集等方面提供重要的科學(xué)依據(jù)。