蘇秋菊 周翔 李光鵬 白春玲 許文濤 劉榜

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2. 內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特 010070；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

基因編輯技術(shù)是通過對目的基因進行編輯，從而實現(xiàn)對基因組精確修飾的一種嶄新方法。目前常用的基因編輯方法主要有：鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）［1］、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸 酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［2］和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR相關(guān)蛋白9（CRISPR associated protein 9，Cas9）［3］，近年來由于 CRISPR/Cas9 具有高效性、易操作、低成本、周期短等優(yōu)點［4］，在動植物的基因修飾中深受青睞。

在動物中，通過對不利基因編輯使其功能喪失來進行動物的改良。Myostation（MSTN）基因編碼的肌肉生長抑制素是一種肌肉生長負調(diào)節(jié)因子［5-6］，動物體內(nèi)缺失或失活可能導(dǎo)致肌肉細胞數(shù)量增加，肌纖維直徑增大，肌纖維數(shù)量增加，肌肉過度發(fā)育，但對動物的生存無影響［7］。自然突變或基因編輯都可能導(dǎo)致MSTN發(fā)生功能性失活，而表現(xiàn)“雙肌”現(xiàn)象。Hanset等發(fā)現(xiàn)自然突變引起“雙肌”的比利時藍牛比普通牛的肌纖維數(shù)量更多［8］。近年來內(nèi)蒙古大學(xué)以牛為研究對象成功進行MSTN的編輯使其缺失了6 bp，其中4 bp在第一外顯子上，因而形成移碼突變，不能產(chǎn)生正常的蛋白質(zhì)而喪失功能，使編輯牛的產(chǎn)肉量和生長速度得到顯著提高。

目前用于基因編輯檢測方法主要有：PCR-限制性核酸內(nèi)切酶（PCR-restriction enzyme，PCRRE），T7 核酸內(nèi)切酶 I（T7 endonuclease I，T7EI），Surveyor核酸酶和高分辨率熔解曲線（High-resolution melting，HRM）分析等。PCR-RE法是根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點的變化，對突變體進行鑒定以及基因分型的方法［9］；T7EI和Surveyor核酸酶是一種非配對內(nèi)切酶，通過識別并切割異源雙鏈DNA，產(chǎn)生兩個或更多個較小的片段，從而達到對突變體進行鑒定的目的［10］；HRM分析法是利用與熒光染料結(jié)合的雙鏈DNA在溫度升高過程中會發(fā)生減色效應(yīng)的物理性質(zhì)，通過檢測雙鏈DNA在溶解過程中釋放的染料熒光信號所形成的特征溶解曲線進行基因分型［11］。雖然這些方法可以成功地用于突變體的篩選或基因分型，但是也存在一定的局限性，諸如需要限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點，酶切不完全，成本較高等。由于基因編輯后缺失的核苷酸數(shù)量最少是1 bp，也有的是幾個bp，所以對于這種小片段的缺失常規(guī)PCR方法無法進行檢測和分型。功能核酸是指可與特定目標物高選擇性結(jié)合［12］或具有催化功能［13］的核酸分子，它具有檢測、識別、催化、電子傳遞、發(fā)光等用途。因此可以在常規(guī)PCR方法基礎(chǔ)上引入功能核酸對小片段的缺失進行檢測和分型。本研究以MSTN編輯牛為研究材料，建立功能核酸PCR（Functional nucleic acid PCR，F(xiàn)NA-PCR）檢測方法，擬對MSTN編輯牛進行檢測和基因分型，為基因編輯動物檢測提供一種簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用MSTN編輯牛樣品（編輯位點：AC_000159.1：g.1102 del GAGTGT）和對照樣品由內(nèi)蒙古大學(xué)提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用氯仿苯酚法提取樣品DNA［14］。DNA濃度由核酸測定儀檢測得到。

1.2.2 引物設(shè)計 使用Primer Premier 5.0軟件，針對編輯位點的兩種等位基因設(shè)計兩條不同的正向引物和一條共用的反向引物，其中一條正向引物是用于檢測野生型等位基因：MSTN-WT-F：5′-ATGCTC GAGGCTTATCTATAGCATTGAAGATTACCATGCCCAC GGAGTGT-3′，3′端終止于編輯位點，同時對它的5′端進行功能核酸接頭設(shè)計，即添加29 bp功能核酸序 列（ATGCTCGAGGCTTATCTATAGCATTGAAG）。本研究所用的功能核酸是與?；蚪M序列不同源的一段核酸序列。另一條正向引物用于檢測編輯型等位基因 ：MSTN-KO-F ：5′-ATTACCATGCCCACGGAGTAG-3′，3′端跨越編輯位點向后延伸6 bp。共用的反向引物 ：MSTN-R ：5′-CTCTTTCCCCTCCTCCTTACA-3′，它位于編輯位點下游（圖1）。引物MSTNWT-F和MSTN-R用于檢測野生型等位基因擴增片段為175 bp，MSTN-KO-F和MSTN-R用于檢測編輯型等位基因擴增片段為140 bp。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

圖1 引物設(shè)計示意圖

1.2.3 FNA-PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 分別以野生型和編輯雜合型（+/-）樣品基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，引物終濃度梯度如表1，并設(shè)置退火溫度為60℃、61℃、62℃、63℃ 4個梯度，三條引物添加在同一體系進行擴增。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用 2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

表1 FNA-PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化引物濃度梯度表

1.2.4 靈敏度測試 將MSTN編輯?；蚪MDNA進行稀釋得到含25 ng、15 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng和0.01 ng的樣品，然后按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系（表2）進行方法靈敏度測試。

表2 FNA-PCR反應(yīng)體系

1.2.5 不同基因型的檢測 選取5個不同基因型個體，用建立的方法進行鑒定及基因分型。

2 結(jié)果

2.1 FNA-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

將針對編輯型和野生型等位基因設(shè)計的正向引物及它們共用的反向引物在同一體系中進行引物濃度和退火溫度的優(yōu)化。當(dāng)以野生型?；蚪MDNA為模板時，在所有條件下都只擴增出一條175 bp目的條帶，說明只有引物MSTN-WT-F和MSTN-R發(fā)揮作用，引物之間無互作且特異性好（圖2）。且當(dāng)MSTN-WT-F引物終濃度為0.2 μmol/L、退火溫度為60℃時擴增條帶最亮；當(dāng)以編輯雜合（+/-）型?；蚪MDNA為模板時，所有條件下都可見兩條明顯的目的條帶（一條是175 bp，另一條是140 bp），且在引物終濃度為 MSTN-WT-F：0.2 μmol/L，MSTNKO-F ：0.4 μmol/L，MSTN-R ：0.6 μmol/L，退火溫度為60℃時，擴增出較亮，更易區(qū)分，且引物二聚體相對較弱的目的條帶（圖3）。綜合兩種不同類型模板體系優(yōu)化結(jié)果可知最優(yōu)條件為：0.2 μmol/L MSTNWT-F，0.4 μmol/L MSTN-KO-F，0.6 μmol/L MSTN-R的引物終濃度，和60℃退火溫度。

圖2 野生型?；蚪MDNA不同引物濃度及退火溫度的PCR結(jié)果

2.2 FNA-PCR靈敏度測試

圖3 編輯雜合型（+/-）?；蚪MDNA不同引物濃度及退火溫度的PCR結(jié)果

按照上述已經(jīng)優(yōu)化好的體系對含25 ng、15 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng和 0.01 ngMSTN編輯?；蚪MDNA成分樣品進行靈敏度檢測。結(jié)果顯示，0.1 ng及以上所有含量梯度均能特異性擴增出預(yù)期兩條目的片段，即在反應(yīng)體系中含0.1 ng的MSTN編輯?；蚪MDNA就可被檢測出，并可對其進行有效鑒別，表明本文中方法的檢出限為0.1 ng（圖4）。

圖4 引物靈敏度檢測結(jié)果

2.3 不同基因型的檢測

利用FNA-PCR方法根據(jù)優(yōu)化好的退火溫度和引物濃度對5個個體進行鑒定及基因分型，每個個體設(shè)置2個重復(fù)。檢測結(jié)果（圖5）顯示，所有檢測結(jié)果中均沒有非特異性擴增，條帶清晰，且雜合型個體中兩條擴增條帶大小差異明顯。以野生型牛個體DNA為模板只能擴增出一條目的片段（175 bp）；以MSTN編輯雜合型（+/-）牛個體DNA為模板可同時擴增出大小為175 bp和140 bp的目的片段，從而實現(xiàn)基因編輯牛和野生型牛個體的有效檢測。

圖5 MSTN編輯牛樣品FNA-PCR檢測結(jié)果

3 討論

自2008年我國啟動轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項后，轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)人乳清白蛋白［15］、人溶菌酶［16］、人乳鐵蛋白［17］的轉(zhuǎn)基因牛羊等不斷被研發(fā)出來并將成為新型的育種材料。由于轉(zhuǎn)入外源基因的轉(zhuǎn)基因動植物一直受到社會質(zhì)疑，轉(zhuǎn)基因生物的研制方向逐漸向內(nèi)源基因的編輯方向發(fā)展，為此基因編輯技術(shù)將成為未來研究的熱點。2018年7 月25 日，歐盟通過了“由基因編輯技術(shù)獲得的生物品種，將被作為轉(zhuǎn)基因生物（GMO），納入歐盟嚴格的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管框架中”的裁決，因此迫切需要建立針對基因編輯產(chǎn)品的檢測技術(shù)平臺，對基因編輯產(chǎn)品進行快速簡便的檢測。本研究建立的FNA-PCR方法通過一次PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，不僅可以對基因編輯個體進行檢測，還可以對其基因型進行判定。FNA-PCR與其它基因編輯生物鑒定或基因分型方法相比具有獨特的優(yōu)勢，與PCR-RE方法相比，F(xiàn)NA-PCR不受限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點的限制，而PCR-RE法需要存在酶切位點才可以進行檢測［18］；與T7EI和Surveyor核酸酶法相比，F(xiàn)NA-PCR能夠準確地對基因型進行區(qū)分，而T7EI和Surveyor核酸酶法無法實現(xiàn)此目的［19］；與本文方法相比，HRM法需要特殊的設(shè)備，成本較高［20］。

FNA-PCR反應(yīng)中引物的設(shè)計是獲得成功的關(guān)鍵之一。FNA-PCR的引物設(shè)計比傳統(tǒng)PCR引物的設(shè)計更加巧妙，既可對編輯樣品進行檢測又能對其進行基因分型。因此設(shè)計引物時應(yīng)該考慮以下幾個問題：（1）用于檢測編輯型等位基因的引物不能在野生型等位基因檢測中發(fā)揮作用，因此，本研究在正向引物的3′端進行了創(chuàng)新性設(shè)計，即兩條正向引物中的一條3′端終止于編輯位點，另一條跨越編輯位點再延伸幾個bp；（2）由于基因編輯后缺失的片段較小，利用傳統(tǒng)的PCR方法無法實現(xiàn)編輯型和野生型的一次性檢測，所以我們在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上進行創(chuàng)新，即在引物5′端連接與本物種基因組序列不同源的功能核酸接頭設(shè)計，這種設(shè)計可使野生型和編輯型等位基因擴增出大小不同且易于區(qū)分的產(chǎn)物；（3）擴增片段不宜過大，最好小于300 bp，以使相差幾十bp的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以得到明顯區(qū)分。

4 結(jié)論

以MSTN編輯牛為研究材料，在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上進行功能核酸接頭設(shè)計的創(chuàng)新，建立的FNAPCR方法不僅能夠快速地檢測出基因編輯動物，還能對其進行分型。本方法簡便、靈敏度高、成本低，為基因編輯動物的檢測提供了新思路。