戴逢斌 劉麗萍 李艾佳 饒書培 陳金煥

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室，北京 100083）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）為茄科枸杞屬多年生多棘刺灌木［1］。果實味甘、性平，富含多種蛋白質、維生素、微量元素及礦物質，尤其富含天然原花青素，可預防并治療多種疾病，可入藥、制茶、防風［2-4］。黑果枸杞植株具有較強的抗逆性，耐鹽堿、抗寒、抗旱，可用于鹽堿地防風固沙、水土保持及綠化，是集生態(tài)價值、經濟價值、營養(yǎng)價值、藥用價值為一體的野生灌木樹種，在生態(tài)建設和區(qū)域經濟發(fā)展中有巨大的應用前景［5］。黑果枸杞主要分布在我國的西北部，集中在青海柴達木盆地（格爾木、都蘭、德令哈等地區(qū)）、甘肅河西走廊（瓜洲、玉門、靖遠等地區(qū)）、內蒙古的額濟納旗、阿拉善左旗和右旗以及新疆塔里木盆地（沙雅、阿克蘇、庫爾勒、巴楚）等地，各自然群體具有豐富的表型多樣性和遺傳多樣性［6-9］。豐富的表型多樣性和遺傳多樣性是遺傳育種的基礎，因此，保護其天然遺傳資源對黑果枸杞的遺傳多樣性研究具有重要意義。

近年來，對黑果枸杞的野蠻采摘導致其野生資源破壞嚴重，野生資源瀕臨滅絕，對黑果枸杞野生資源的合理保護與利用已迫在眉睫［10］。黑果枸杞野生資源量在西北地區(qū)極為豐富，根蘗育苗、種子育苗、嫩枝扦插育苗都極為容易，組織培養(yǎng)體系建立可能更有利于轉化體系構建。根蘗育苗需提前截斷主根，待春季使其萌發(fā)新苗，再挖取主根旁萌發(fā)的根蘗苗移栽，且移栽過程中多需攜帶部分母根才能成活，因此該方法對母株的影響較大，往往影響母株的正常生長［11］。種子育苗由于對溫度要求較高，在播種前需進行種子處理，且為提高發(fā)芽率和幼苗成活率，需安裝噴灌設施，且溫室中種植的黑果枸杞由于莖葉柔嫩，易受到大青蟲和螻蛄的危害［12］。扦插育苗時間受季節(jié)氣候的影響較大，一般于4月中下旬萌發(fā)前或秋季進行扦插［13］。植物組織培養(yǎng)技術既可以保留植株原有的基因型和優(yōu)良性狀，又可將優(yōu)良單株快速繁殖成無性系，迅速在生產應用中推廣［14］。因此，對黑果枸杞的組培快速繁殖研究尤其重要。

目前，對黑果枸杞的組織培養(yǎng)快繁研究已取得一定進展，包振華等［15］發(fā)現培養(yǎng)基中細胞分裂素占比高時易產生愈傷組織，不定芽數量減少，葉片多，不適合繼代，且1/2MS的生根率高于MS。杜敏智［16］采用大果黑果枸杞的嫩莖段為材料，發(fā)現ZT對大果黑果枸杞增殖培養(yǎng)的效果要顯著優(yōu)于6-BA，且在大果黑果枸杞的增殖培養(yǎng)過程中，提高光照強度、增加光照時間，或增加培養(yǎng)基中瓊脂濃度，可有效減少組培苗玻璃化程度。孫曉紅［17］以黑果枸杞成熟葉片為外植體，誘導愈傷組織及不定芽的分化，發(fā)現適當增加6-BA會增加愈傷組織誘導率和分化率，但玻璃化也更加明顯。

雖然目前已有部分關于黑果枸杞組織培養(yǎng)的研究報道，但都局限于單一種源（品種）培養(yǎng)條件探索，因此，常出現在各階段培養(yǎng)基條件的摸索中，不同實驗室對所采集的不同種質苗采用同一培養(yǎng)基配方時，僅有部分或幾乎都不能正常生長，給黑果枸杞的工廠化育苗帶來不便。此外，大部分報道中都提到不同程度的玻璃化的現象，說明玻璃化問題沒有得到根本解決。

本試驗以7個不同種源地的黑果枸杞為研究材料，通過不同培養(yǎng)基的設置，分析不同濃度生長素及細胞分裂素在黑果枸杞生根及分化過程中的影響，旨在提供一種適用于黑果枸杞不同種質資源、具有普遍適用性且操作過程簡單方便、成苗繁殖速度快、成活率高的高效快速繁殖方法，為黑果枸杞的后續(xù)功能研究及大規(guī)模育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從新疆阿克蘇（AKeSu，簡寫為AKS）、庫爾勒（KuErLe，簡寫為KEL）、巴楚（BaChu，簡寫為BC）、沙雅（ShaYa，簡寫為SY）和青海格爾木（GeErMu，簡寫為GEM）、大格勒（DaGeLe，簡寫為DGL）以及內蒙古阿拉善左旗（ALaShan，簡寫為ALS）（名稱下同）等7個地區(qū)收集到的不同種源的野生黑果枸杞種子及葉片。

1.2 方法

1.2.1 種源親緣關系鑒定 通過采集7個種源黑果枸杞的葉片進行轉錄組測序并鑒定了黑果枸杞的EST-SSR位點，根據黑果枸杞SSR位點，設計引物，提取黑果枸杞葉片DNA進行擴增，從中選取條帶清晰、多態(tài)性良好的引物，在其5′端添加熒光后重新合成熒光引物，重新擴增并進行毛細管電泳，根據毛細管電泳結果對7個種源地進行遺傳多樣性分析。

1.2.2 外植體消毒 將不同地區(qū)收集到的野生黑果枸杞種子，挑選飽滿個大、形狀均一的一定數量種子，裝入無菌的2 mL離心管，先用2 mL 75%酒精消毒30 s，用無菌蒸餾水沖洗2-3次，然后用2 mL 70%的84消毒液消毒6 min，蒸餾水再沖洗4-5次，吸干水分，用已滅菌的鑷子接種于Murashige和Skoog（MS）基本培養(yǎng)基（MS 4.43 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH 5.8-6.0），制備無菌苗，長出的小苗待用。

1.2.3 培養(yǎng)條件 將黑果枸杞材料放置于北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室組培室，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光周期16 h/8 h（晝／夜），光照強度3 000 lx。

1.2.4 嫩莖段誘導不定芽分化培養(yǎng)基的篩選 種子萌發(fā)后，待幼苗長至5 cm時，將其剪成約1 cm的莖段，去除葉片，分別轉接至含不同濃度的6-BA和IAA的MS分化培養(yǎng)基中，誘導分化叢生芽。以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.2 mg/L（單位下同）為啟動培養(yǎng)基進行不定芽誘導，根據誘導情況，在此培養(yǎng)基基礎上調整不同濃度的激素組合（表1），選出適于不同種源黑果枸杞莖段誘導分化的培養(yǎng)基。

表1 莖段誘導分化培養(yǎng)基的篩選設置

1.2.5 葉片誘導不定芽分化培養(yǎng)基的篩選 選取生長良好的不同種源和培養(yǎng)基，挑選成熟的葉片，接種于含不同6-BA濃度的培養(yǎng)基上。每個種源接5瓶，每瓶接5-6個生長旺盛的葉片。所用培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L及MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

1.2.6 莖段誘導生根培養(yǎng)基的篩選 選取長勢良好、生長一致的種源和株系，將不定芽或幼苗剪成約2 cm，且?guī)в?-2個小葉片的莖段，分別接種于不同的生根培養(yǎng)基中，每個種源接種3株×8瓶，共24株。研究不同組合的激素對黑果枸杞誘導生根的影響，一周后統(tǒng)計生根情況，并計算生根率。生根率（%）=生根幼苗數/接種總幼苗數。根據已有文獻報道，適宜誘導黑果枸杞生根的培養(yǎng)基為MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L［17］，但根據包振華等［15］研究，培養(yǎng)基中添加1/2MS的平均生根率高于MS和1/4MS，因此本研究以此激素組合為啟動培養(yǎng)基，并添加1/2MS粉（2.18 g/L），根據不同種源的黑果枸杞生根情況，分別改進不同濃度的激素組合，探索適于不同種源黑果枸杞生根的培養(yǎng)基（表2）。

表2 莖段誘導生根培養(yǎng)基的篩選設置

2 結果

2.1 種源親緣關系鑒定

根據前期基于黑果枸杞轉錄組序列的EST-SSR標記開發(fā)分析，通過毛細管電泳，對擴增產物峰值進行分析，構建了7個種源地聚類分析圖（圖1），阿克蘇種源與庫爾勒種源的黑果枸杞在遺傳上相近，格爾木與大格勒遺傳距離較近，巴楚與沙雅相近，并且與格爾木、大格勒的遺傳距離較其他3個種近，而內蒙古的阿拉善獨立為一支，沒有與之最相近的種源地。

圖1 7個黑果枸杞種源地聚類分析圖

2.2 嫩莖段誘導不定芽分化培養(yǎng)基的篩選

在篩選嫩莖段誘導不定芽的培養(yǎng)基過程中，啟動培養(yǎng)基MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.2 mg/L分化前期有明顯的玻璃化傾向，后期幾乎所有莖段分化的不定芽均嚴重玻璃化，葉片肥厚，水分含量大，生長停滯（表3）。

表3 不同培養(yǎng)基誘導莖段分化叢生芽的比較

通過增加IAA濃度的方式，達到降低6-BA在培養(yǎng)基中激素比例的目的，6 d時部分基因型有芽點長出，但后期莖段誘導分化出的不定芽仍然嚴重玻璃化；培養(yǎng)基中降低6-BA濃度，10 d時所有莖段表面分化出的不定芽小葉正常，30和45 d時，發(fā)現不定芽與前期相比，大小保持在剛分化狀態(tài)，生長緩慢，但無玻璃化；

增加蔗糖濃度，培養(yǎng)6 d時，發(fā)現莖段表面已分化出綠色的小芽點，12 d后，芽點已發(fā)育成很小的不定芽，但有明顯的玻璃化傾向；增加瓊脂濃度，分化情況和增加蔗糖時類似，雖然能分化出不定芽，但有較明顯的玻璃化傾向；蔗糖和瓊脂濃度均增加時，能誘導出不定芽，但是玻璃化現象依然存在。增加瓊脂濃度，依然加入0.1 mg/L 6-BA，不添加IAA，培養(yǎng)5 d時，莖段表面有綠色的小芽點生成，8 d時芽點已繼續(xù)分化為小的成形的不定芽，所有基因型也無玻璃化出現，培養(yǎng)基穩(wěn)定，后期可以長成正常的叢生芽。在前面的基礎上增加6-BA濃度至0.2 mg/L，培養(yǎng)4 d時，有小芽點生成，但是生長緩慢，后期葉片肥厚，玻璃化嚴重，生長停滯。繼續(xù)增加6-BA濃度至0.3 mg/L，雖能誘導出不定芽，但后期也存在嚴重的玻璃化現象。

2.3 葉片誘導不定芽分化培養(yǎng)基的篩選

先以新疆的沙雅（SY）、阿克蘇株系2（AKS-L2）、阿克蘇株系3（AKS-L3）的成熟葉片作為代表材料，接種30 d，可以看到部分葉片傷口處愈傷組織分化出不定芽，還有很多即將分化成不定芽的芽點（圖2）。45 d時統(tǒng)計芽誘導情況（表4），在得到更多的種源材料后，發(fā)現在6-BA濃度為1.0 mg/L時均能分化出不定芽，其中GEM、DGL、KEL、BC均分化良好，內蒙古的ALS分化效果次之。

表4 葉片誘導不定芽分化結果

圖2 不同種源黑果枸杞葉片分化30 d不定芽生長情況

2.4 莖段誘導生根

為觀察植株生根情況，先以植物凝膠作為凝固劑。在1/2MS+蔗糖30 g/L+植物凝膠2 g/L+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L的培養(yǎng)基中，以阿拉善（ALS）、沙雅（SY）、大格勒（DGL）、庫爾勒（KEL）、阿克蘇株系1（AKS-L1）作為種源，在接種20 d時統(tǒng)計生根情況，發(fā)現所有黑果枸杞植株基部只膨大形成愈傷，不生根。因此，該培養(yǎng)基并不適合黑果枸杞的生根。

對于1/2MS+蔗糖30 g/L+植物凝膠2 g/L+IBA（0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8 mg/L），以添加不同濃度梯度IBA作誘導激素，以格爾木（GEM）種源為材料，培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計生根情況（表5）。接種的所有莖段生根率極低，莖段基部有膨大長成的愈傷組織。培養(yǎng)20 d時，大部分都還未生根，莖段基部只膨大長成愈傷。30 d時，發(fā)現只有少數莖段產生新生根，且具有明顯的偶然性。添加0.2、0.25、0.4、0.5、0.75和0.8 mg/L濃度的IBA，其生根率依次為36%、8.33%、4.17%、4.16%、4.16%和2.5%?？傊?，在這幾類培養(yǎng)基中，黑果枸杞生根啟動時間明顯延遲，即使生根，生根數量也稀少，且長勢較弱。因此，影響生根的可能的因素仍需要進一步深入探究。

表5 20 d時不同IBA濃度下GEM種源黑果枸杞植株生根情況

對于1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L+IBA 1 mg/L組合，以阿克蘇株系1（AKS-L1）、阿克蘇株系2（AKS-L2）、阿克蘇株系3（AKS-L3）、阿克蘇株系7（AKS-L7）、大格勒（DGL）、沙雅（SY）等6個種源為材料，培養(yǎng)13 d時統(tǒng)計生根率（表6），各種源或同一種源的不同株系無菌苗均有生根，但生根率不高，在6%-30%。

表6 IBA濃度為1 mg/L時各種源生根情況

在1/2MS+蔗糖30g/L+瓊脂7.5 g/L+IBA（0.1、0.25 mg/L）兩種組合下，根據種源聚類關系分別以4個具有代表性的阿拉善（ALS）、沙雅（SY）、格爾木（GEM）、阿克蘇株系3（AKS-L3）種源為材料，將生長健壯的不定芽轉接至新的誘導生根培養(yǎng)基中。發(fā)現植株地上部分開始逐漸長高，培養(yǎng)5 d時，大部分植株從底部開始生根；14 d時，當IBA為0.1mg/L時（表7），接種的幾個種源植株均有生根，根長在0.2-1 cm不等。21 d時，根明顯伸長，且有明顯的根毛。在IBA濃度為0.25 mg/L時（表8），各種質苗莖段基部均沒有膨大，直接生根。相比較而言，IBA濃度為0.25 mg/L時生根率更高，效果更好，且生根早，5 d左右即開始生根，20 d后，幾乎所有接種莖段均能生根。

表7 IBA濃度為0.1 mg/L時各種源生根情況

表8 IBA濃度為0.25 mg/L時各種源生根情況

3 討論

在嫩莖段誘導不定芽分化培養(yǎng)基的篩選過程中，針對啟動培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1 mg/L +IAA 0.2 mg/L中出現的玻璃化現象，本研究采取了8種措施以減輕玻璃化。結果顯示，增加IAA濃度對莖段誘導叢生芽玻璃化問題，無明顯緩解甚至加重玻璃化；采用降低6-BA濃度的方法一定程度上對玻璃化的減輕有一定效果，但是，莖段誘導分化產生芽的時間明顯延遲，并且，芽后期很難繼續(xù)長大；改變蔗糖或瓊脂的濃度雖能誘導出不定芽，但生長后期還是存在不同程度的玻璃化現象。因此，該6-BA和IAA激素濃度組合并不適合作為莖段誘導分化。

增加瓊脂濃度（7 g/L）且分別單獨添加0.2 mg/L 6-BA和0.3 mg/L 6-BA時，均能誘導出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化現象，培養(yǎng)基不穩(wěn)定。單獨加入0.1 mg/L 6-BA時，8 d左右，可以看到有芽點長出，沒有愈傷，也無玻璃化問題，后期可以生長為成正常的小芽，培養(yǎng)基穩(wěn)定，重復性好，因此，該濃度適合莖段誘導叢生芽，培養(yǎng)基條件為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+6-BA 0.1 mg/L。

在篩選葉片誘導不定芽分化的培養(yǎng)基過程中，較高濃度的細胞分裂素可能對叢生芽的增殖具有明顯的促進作用［19］。本研究中先以新疆的2個材料SY、AKS作為代表，以6-BA濃度為變量，研究了不同濃度的6-BA對成熟黑果枸杞葉片直接誘導分化成苗的影響，在分化30 d時，0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中，3種基因型的葉片均能誘導出不定芽，其中SY的不定芽數最多，生長也最旺盛；當6-BA調為1.0 mg/L時，AKS-L2及SY均能分化出不定芽，但AKS-L3未能分化出芽，猜測6-BA濃度過高抑制了葉片的分化。因此，最適宜多基因型葉片直接誘導不定芽的培養(yǎng)基配方為蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L，后又用其余5個種源進行了驗證，發(fā)現除了種源地相距較遠的內蒙古ALS，其余均能良好分化。

在莖段誘導生根培養(yǎng)基的篩選過程中，為方便觀察枸杞生根情況，最先選用透明植物凝膠作為MS培養(yǎng)基中的凝固劑，對不同種源嫩莖段進行生根培養(yǎng)。結果顯示，IBA 0.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L組合在接種20 d時，幾乎所有種源的黑果枸杞植株基部只膨大，不生根；然后，仍以植物凝膠做凝固劑，以GEM作材料，以不同濃度梯度IBA（0.2、0.25、0.4、0.5、0.75和0.8 mg/L）做誘導激素繼續(xù)摸索誘導生根的條件，結果顯示，設置不同濃度IBA梯度后，依然是大多數只出現基部膨大，少數種源可以生根，生根數量也稀少。

針對莖段基部只膨大不生根的問題，推斷可能是培養(yǎng)基中使用的植物凝膠影響了培養(yǎng)基的凝固狀態(tài)，從而影響到植株生根。因此，改用瓊脂粉代替植物凝膠，因有報道顯示黑果枸杞在組培時使用IBA的生根率更高［20］，仍然只用IBA激素。將IBA濃度范圍擴大至1 mg/L，結果顯示，各種源均有不同比率的生根（表6），為6%-30%，生根率很低。根據包振華等［15］的研究，較低濃度IBA對植株生根有一定的誘導作用，且1/2MS培養(yǎng)基中組培苗生根率和平均生根數相對于MS培養(yǎng)基及1/4MS培養(yǎng)基均比較高，因此，又以IBA濃度為0.1 和0.25 mg/L 2個濃度作為比較，在這兩種情況下，各種源均可以在莖段基部直接生根，且生根率較高，IBA含量為0.25 mg/L時生根率更高（表8），且生根更早，5 d左右即開始生根，20 d后各種源接種莖段生根率均接近100%，說明使用0.25 mg/L IBA誘導生根效果更好，因此，具有不同種源誘導生根普適性的培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L+IBA 0.25 mg/L。

4 結論

獲得適于多基因型黑果枸杞嫩莖段誘導不定芽分化、葉片誘導不定芽以及莖段誘導生根的培養(yǎng)基，成功建立了適用于不同種源多基因型的快速繁殖體系，使得在短時間內獲得大量的不同種質來源的黑果枸杞幼苗成為可能。