王姣 張水 張婧柔 邵貴芳 鄧明華
(云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院 昆明 650201)
辣椒(Capsicum annuumL.)是茄科辣椒屬一年生草本植物,在我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。優(yōu)良品種的培育可以提高辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量,因此,培育出優(yōu)良的品種有著重要的意義。辣椒是常異花授粉植物,雜交優(yōu)勢明顯,在生產(chǎn)中,F(xiàn)1雜交品種已廣泛應(yīng)用。辣椒胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)是雜交優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)和主要途徑,是辣椒育種研究的主要方向。CMS在自然界普遍存在,已在200多個物種中發(fā)現(xiàn)[1]。CMS植株不能產(chǎn)生正??捎幕ǚ?、花藥或雄配子,大量研究表明,這種雄性不育現(xiàn)象與植物的能量代謝異常有關(guān)[2]。
線粒體是植物正常生長的能量工廠,為植物提供能量。COX3是線粒體呼吸鏈第4個復合體亞基細胞色素氧化酶第三亞基編碼的基因,是呼吸鏈的重要組成部分,與線粒體的能量代謝直接有關(guān)[3]。線粒體呼吸鏈包含多個復合體:復合體Ⅰ(NADH脫氫酶)、復合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)、復合體Ⅲ(細胞色素C還原酶)和復合體Ⅳ(細胞色素C氧化酶)[4]。除此之外,還有復合體Ⅴ,即F0F1-ATP合酶,通常代表F0F1-ATP合酶的F0亞基部分。
在野生型水稻CMS系RT98A和煙草CMSⅠ、CMSⅡ中鑒定到復合體Ⅰ的nad7和nad9[5]。在煙草CMSⅡ中,整個nad7缺失導致CMS,煙草CMSⅠ中,nad7外顯子缺失導致CMS[5]。在復合體Ⅳ中,DC-CMS蘿卜的orf463序列是由部分COXⅠ序列和一段未知的1 261 bp序列組成[6]。HLCMS水稻中,orfH79與COXⅡ表現(xiàn)出高度的同源性[7]。在復合體Ⅴ中,Boro CMSⅡ-型水稻和向日葵PEF1-CMS,水稻的orf79和atp6共轉(zhuǎn)錄[8-9],向日葵中檢測到與CMS相關(guān)的0.5 kb序列插入到atp9的3′上游序列[10]。同時,在線粒體中有很多與呼吸鏈相關(guān)的基因被克隆,其中,甜菜CMS的atpA、COXⅠ、COXⅡ和orf187被克隆,并進行了表達分析,發(fā)現(xiàn)保持系和CMS系編碼的氨基酸和核苷酸序列都發(fā)生了改變,此外相同基因在兩系同一個花蕾發(fā)育時期的表達存在差異[11]。周曉娟等[12]發(fā)現(xiàn)洋蔥atp6在保持系和CMS系之間的表達存在差異。劉科偉等[13]發(fā)現(xiàn)辣椒CMS相關(guān)基因orf456只在CMS系中表達,推測該基因控制辣椒花藥中蛋白的表達,引起小孢子敗育,進而導致敗育。
在辣椒CMS中,很多能量代謝相關(guān)基因在CMS系和保持系的小孢子發(fā)育表達量存在差異[14-16]。但有關(guān)COX3在辣椒胞質(zhì)雄性不育中的相關(guān)研究未見報道。本研究以辣椒CMS系和保持系為實驗材料,分析COX3在兩系中的差異,為研究辣椒CMS與能量代謝的關(guān)系提供參考。
實驗材料為湖南省蔬菜研究所選育的辣椒CMS系9704A和保持系9704B,種植于云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院試驗基地。取盛花期保持系9704B的莖、葉、胎座、果皮、種子5個不同的組織進行表達。同時取兩系花蕾的4個不同發(fā)育階段(造孢細胞增殖期、花粉母細胞減數(shù)分裂期、小孢子單核期和小孢子成熟期)為實驗材料進行發(fā)育過程表達分析。
1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizal試劑提取所有材料的RNA,在-80℃保存RNA,利用紫外分光光度計測定其濃度和純度,對符合要求的RNA樣品用TaKaRa試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存。
1.2.2COX3的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中辣椒線粒體DNA的全序列,用Primer 5.0軟件設(shè)計特異引物,用于COX3編碼區(qū)全序列的擴增,上游引物F1 :5′-TCGGGTCATTTCTTGGTG-3′,下游引物 R1 :5′-TAGACCCCAAAGAGCCCT-3′。所用引 物由擎科生物技術(shù)有限公司昆明分部合成。PCR反應(yīng)體系為1 μL cNDA、22 μL 金牌 mix和上下游引物各 1 μL。PCR 反應(yīng)程序為 98℃ 2 min;98℃ 10 s,56℃ 20 s,72℃ 18 s,35 個循環(huán) ;72℃ 5 min。
1.2.3 生物信息學分析 對獲得的PCR擴增條帶進行雙向測序,根據(jù)獲得的序列進行相關(guān)分析:推導出該基因的氨基酸序列及分子量、等電點;預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位情況和保守結(jié)構(gòu)域;分析氨基酸的同源性及構(gòu)建多種物種進化樹。所用的軟件及服務(wù)器網(wǎng)址參照邵貴芳等[4]報道。
1.2.4 實時熒光定量PCR分析 采用TaKaRa熒光定量試劑盒,以兩系4個不同發(fā)育階段的花蕾cDNA為模板,設(shè)計引物F2:5′-ACTGCTCGTTTTTCCTTC-C-3′,R2 :5′-TTTTCGGGCTTCTTCTCAT-3′。以辣椒Actin片段為內(nèi)標(引物F3:5′-TGCAGGAATCCACGAGACTAC-3′和 R3 :5′-TACCACCACTGAGCACAATGTT-3′),運用Applied Biosystem熒光定量PCR儀進行q-PCR擴增。反應(yīng)體系為10 μL的SYBR Premix ExTaq Ⅱ、上下游引物各 0.8 μL(10 μmol/L)、2 μL的 cDNA模 板、0.4 μL的 POX Reference DyeⅡ 和6 μL的 ddH2O。反應(yīng)程序為 95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40個循環(huán),每個樣品重復3次。數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進行相對表達量計算[17]。
以辣椒CMS系和保持系的cDNA為模板,采用特異性引物F1和R1擴增CaCOX3(圖1)。經(jīng)測序,獲得大小為1 100 bp片段,與預期目的基因大小相符。
圖1 辣椒CaCOX3的擴增結(jié)果
經(jīng)RT-PCR擴增獲得目的基因CaCOX3的編碼區(qū)全長為798 bp,編碼265個氨基酸(圖2)。生物信息學分析,CaCOX3編碼氨基酸的分子量為29.88 kD,等電點為6.854。通過SOPMA程序預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),含有α螺旋135個(50.94%)、延伸鏈43個(16.23%)、β轉(zhuǎn)角16個(6.04%)和無規(guī)則卷曲76個(26.79%)。預測辣椒CaCOX3蛋白定位在細胞質(zhì)中的概率為94.1%。
圖2 CaCOX3的CDS全序列及其編碼的氨基酸序列
對保持系和CMS系CaCOX3蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)進行對比,兩者之間的氨基酸序列沒有差異。通過BLASTP比對,辣椒CaCOX3氨基酸序列與煙草(Nicotiana tabacum,BAD83521.2)、 馬鈴薯(Solanum tuberosum,AAM47526.1)、下垂辣椒(C. baccatum,PHT41048.1)、 酸 漿(Physalis heterophylla,AKZ24 689.1)、維吉尼亞酸漿(Physalis virginiana,AKZ24690.1)、 西 瓜(Citrullus lanatus,YP_003587238.1)、 刺 槐(Rhazya stricta,YP_009041182.1) 和 百 脈 根(Lotus japonicus,YP_005090497.1)的同源性分別為99%、95%、96%、95%、95%、98%、94% 和 98%。 采 用 MegAlin、MEGA7.0等構(gòu)建COX3進化樹,結(jié)果(圖3和圖4)表明,辣椒CaCOX3與煙草的COX3的親緣關(guān)系近。
通過分析CaCOX3在辣椒保持系9704B不同組織的表達(圖5)發(fā)現(xiàn),該基因在5個組織中表達存在差異,葉中的表達量最低,果中表達最高,它們之間相差9倍,同莖相比,葉和種子的表達量低于莖。
CaCOX3在保持系和CMS系中的表達量如圖6所示。保持系9704B中,該基因在造孢細胞增殖期表達量最高,隨著小孢子的發(fā)育,其表達量不斷降低。CMS系9704A中,該基因在小孢子成熟期表達量最高,在小孢子發(fā)育的過程中花粉母細胞減數(shù)分裂期表達量最低,小孢子單核期、小孢子成熟期表達量呈現(xiàn)上升趨勢。在兩系小孢子單核期,兩者之間的差異不明顯,在其他3個時期存在很大差異。在小孢子發(fā)育的造孢細胞增殖期,兩系存在差異顯著性,保持系是CMS系的6.4倍。在花粉母細胞減數(shù)分裂期,保持系和CMS系的表達量接近6∶1,保持系明顯高于CMS系。在小孢子成熟期,CMS系高于保持系,是保持系的2倍。結(jié)果表明,在保持系和CMS系中,該基因的表達量存在較大差異,可能與雄性不育的形成有關(guān)。
圖3 辣椒與其他物種COX3氨基酸比對
圖4 辣椒與其他物種COX3氨基酸進化樹分析
圖5 CaCOX3在9704B不同組織中的表達分析
圖6 9704A和9704B花蕾不同時期CaCOX3的表達分析
線粒體呼吸鏈的最后一個酶是線粒體細胞色素c氧化酶,它將電子從細胞色素c驅(qū)動到氧分子[18]。COX1、COX2和COX3是由線粒體基因組編碼的3個細胞色素c氧化酶的核心基因。研究表明,COX3在細胞色素c氧化酶中最保守,常用作物種分子系統(tǒng)演化和分類的有效基因[19]。在紅麻CMS系和保持系線粒體基因組研究中,COX3的組織形式在兩系中存在差異[20]。在粘類小麥CMS基因研究中,COX3在4種CMS系中的轉(zhuǎn)錄本小于保持系,推測基因可能參與粘類小麥CMS的形成[21]。本研究發(fā)現(xiàn),CaCOX3在花蕾的不同時期,保持系在造孢細胞增殖期、花粉母細胞減數(shù)分裂期的表達量遠高于CMS系。根據(jù)目前研究,花粉敗育主要發(fā)生在單子葉植株小孢子成熟后期,雙子葉植物發(fā)生在四分體時期或小孢子發(fā)育時期[22]。辣椒是典型的雙子葉植物,在小孢子發(fā)育時,能量代謝發(fā)生改變,易造成不育現(xiàn)象的產(chǎn)生。CaCOX3作為呼吸作用中關(guān)鍵性基因,呼吸作用消耗有機物質(zhì),釋放出能量用于植物的正常發(fā)育,保持系中該基因的表達量高,釋放出的能量多,而CMS系該基因表達量少,釋放出的能量少,因而造成了CMS系的小孢子不能正常生長發(fā)育,這可能是造成CMS的原因。在小孢子單核期,兩系之間該基因的表達量幾乎一致,但由于CMS系在小孢子花粉母細胞減數(shù)分裂期能量不足,小孢子正常生長發(fā)育被打破,因而后期的能量是否充足,對小孢子能夠正常發(fā)育的意義不大。
克隆獲得CaCOX3,其在辣椒胞質(zhì)雄性不育9704A和保持系9704B中表達量存在差異,可能引起能量代謝異常,造成雄性不育。