王姣 張水 張婧柔 邵貴芳 鄧明華

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院 昆明 650201）

辣椒（Capsicum annuumL.）是茄科辣椒屬一年生草本植物，在我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。優(yōu)良品種的培育可以提高辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此，培育出優(yōu)良的品種有著重要的意義。辣椒是常異花授粉植物，雜交優(yōu)勢(shì)明顯，在生產(chǎn)中，F(xiàn)1雜交品種已廣泛應(yīng)用。辣椒胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是雜交優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)和主要途徑，是辣椒育種研究的主要方向。CMS在自然界普遍存在，已在200多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)［1］。CMS植株不能產(chǎn)生正?？捎幕ǚ?、花藥或雄配子，大量研究表明，這種雄性不育現(xiàn)象與植物的能量代謝異常有關(guān)［2］。

線粒體是植物正常生長的能量工廠，為植物提供能量。COX3是線粒體呼吸鏈第4個(gè)復(fù)合體亞基細(xì)胞色素氧化酶第三亞基編碼的基因，是呼吸鏈的重要組成部分，與線粒體的能量代謝直接有關(guān)［3］。線粒體呼吸鏈包含多個(gè)復(fù)合體：復(fù)合體Ⅰ（NADH脫氫酶）、復(fù)合體Ⅱ（琥珀酸脫氫酶）、復(fù)合體Ⅲ（細(xì)胞色素C還原酶）和復(fù)合體Ⅳ（細(xì)胞色素C氧化酶）［4］。除此之外，還有復(fù)合體Ⅴ，即F0F1-ATP合酶，通常代表F0F1-ATP合酶的F0亞基部分。

在野生型水稻CMS系RT98A和煙草CMSⅠ、CMSⅡ中鑒定到復(fù)合體Ⅰ的nad7和nad9［5］。在煙草CMSⅡ中，整個(gè)nad7缺失導(dǎo)致CMS，煙草CMSⅠ中，nad7外顯子缺失導(dǎo)致CMS［5］。在復(fù)合體Ⅳ中，DC-CMS蘿卜的orf463序列是由部分COXⅠ序列和一段未知的1 261 bp序列組成［6］。HLCMS水稻中，orfH79與COXⅡ表現(xiàn)出高度的同源性［7］。在復(fù)合體Ⅴ中，Boro CMSⅡ-型水稻和向日葵PEF1-CMS，水稻的orf79和atp6共轉(zhuǎn)錄［8-9］，向日葵中檢測(cè)到與CMS相關(guān)的0.5 kb序列插入到atp9的3′上游序列［10］。同時(shí)，在線粒體中有很多與呼吸鏈相關(guān)的基因被克隆，其中，甜菜CMS的atpA、COXⅠ、COXⅡ和orf187被克隆，并進(jìn)行了表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)保持系和CMS系編碼的氨基酸和核苷酸序列都發(fā)生了改變，此外相同基因在兩系同一個(gè)花蕾發(fā)育時(shí)期的表達(dá)存在差異［11］。周曉娟等［12］發(fā)現(xiàn)洋蔥atp6在保持系和CMS系之間的表達(dá)存在差異。劉科偉等［13］發(fā)現(xiàn)辣椒CMS相關(guān)基因orf456只在CMS系中表達(dá)，推測(cè)該基因控制辣椒花藥中蛋白的表達(dá)，引起小孢子敗育，進(jìn)而導(dǎo)致敗育。

在辣椒CMS中，很多能量代謝相關(guān)基因在CMS系和保持系的小孢子發(fā)育表達(dá)量存在差異［14-16］。但有關(guān)COX3在辣椒胞質(zhì)雄性不育中的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究以辣椒CMS系和保持系為實(shí)驗(yàn)材料，分析COX3在兩系中的差異，為研究辣椒CMS與能量代謝的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為湖南省蔬菜研究所選育的辣椒CMS系9704A和保持系9704B，種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院試驗(yàn)基地。取盛花期保持系9704B的莖、葉、胎座、果皮、種子5個(gè)不同的組織進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)取兩系花蕾的4個(gè)不同發(fā)育階段（造孢細(xì)胞增殖期、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期、小孢子單核期和小孢子成熟期）為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行發(fā)育過程表達(dá)分析。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizal試劑提取所有材料的RNA，在-80℃保存RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，對(duì)符合要求的RNA樣品用TaKaRa試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存。

1.2.2COX3的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中辣椒線粒體DNA的全序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，用于COX3編碼區(qū)全序列的擴(kuò)增，上游引物F1 ：5′-TCGGGTCATTTCTTGGTG-3′，下游引物 R1 ：5′-TAGACCCCAAAGAGCCCT-3′。所用引 物由擎科生物技術(shù)有限公司昆明分部合成。PCR反應(yīng)體系為1 μL cNDA、22 μL 金牌 mix和上下游引物各 1 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 18 s，35 個(gè)循環(huán) ；72℃ 5 min。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)獲得的PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行雙向測(cè)序，根據(jù)獲得的序列進(jìn)行相關(guān)分析：推導(dǎo)出該基因的氨基酸序列及分子量、等電點(diǎn)；預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位情況和保守結(jié)構(gòu)域；分析氨基酸的同源性及構(gòu)建多種物種進(jìn)化樹。所用的軟件及服務(wù)器網(wǎng)址參照邵貴芳等［4］報(bào)道。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用TaKaRa熒光定量試劑盒，以兩系4個(gè)不同發(fā)育階段的花蕾cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物F2：5′-ACTGCTCGTTTTTCCTTC-C-3′，R2 ：5′-TTTTCGGGCTTCTTCTCAT-3′。以辣椒Actin片段為內(nèi)標(biāo)（引物F3：5′-TGCAGGAATCCACGAGACTAC-3′和 R3 ：5′-TACCACCACTGAGCACAATGTT-3′），運(yùn)用Applied Biosystem熒光定量PCR儀進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10 μL的SYBR Premix ExTaq Ⅱ、上下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L）、2 μL的 cDNA模 板、0.4 μL的 POX Reference DyeⅡ 和6 μL的 ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算［17］。

2 結(jié)果

2.1 CaCOX3的擴(kuò)增

以辣椒CMS系和保持系的cDNA為模板，采用特異性引物F1和R1擴(kuò)增CaCOX3（圖1）。經(jīng)測(cè)序，獲得大小為1 100 bp片段，與預(yù)期目的基因大小相符。

圖1 辣椒CaCOX3的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CaCOX3的生物信息學(xué)分析

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因CaCOX3的編碼區(qū)全長為798 bp，編碼265個(gè)氨基酸（圖2）。生物信息學(xué)分析，CaCOX3編碼氨基酸的分子量為29.88 kD，等電點(diǎn)為6.854。通過SOPMA程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有α螺旋135個(gè)（50.94%）、延伸鏈43個(gè)（16.23%）、β轉(zhuǎn)角16個(gè)（6.04%）和無規(guī)則卷曲76個(gè)（26.79%）。預(yù)測(cè)辣椒CaCOX3蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中的概率為94.1%。

2.3 CaCOX3氨基酸序列比對(duì)及其進(jìn)化關(guān)系

圖2 CaCOX3的CDS全序列及其編碼的氨基酸序列

對(duì)保持系和CMS系CaCOX3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，兩者之間的氨基酸序列沒有差異。通過BLASTP比對(duì)，辣椒CaCOX3氨基酸序列與煙草（Nicotiana tabacum，BAD83521.2）、 馬鈴薯（Solanum tuberosum，AAM47526.1）、下垂辣椒（C. baccatum，PHT41048.1）、 酸 漿（Physalis heterophylla，AKZ24 689.1）、維吉尼亞酸漿（Physalis virginiana，AKZ24690.1）、 西 瓜（Citrullus lanatus，YP_003587238.1）、 刺 槐（Rhazya stricta，YP_009041182.1） 和 百 脈 根（Lotus japonicus，YP_005090497.1）的同源性分別為99%、95%、96%、95%、95%、98%、94% 和 98%。 采 用 MegAlin、MEGA7.0等構(gòu)建COX3進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3和圖4）表明，辣椒CaCOX3與煙草的COX3的親緣關(guān)系近。

2.4 CaCOX3的組織表達(dá)分析

通過分析CaCOX3在辣椒保持系9704B不同組織的表達(dá)（圖5）發(fā)現(xiàn)，該基因在5個(gè)組織中表達(dá)存在差異，葉中的表達(dá)量最低，果中表達(dá)最高，它們之間相差9倍，同莖相比，葉和種子的表達(dá)量低于莖。

2.5 CaCOX3在保持系和CMS系花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

CaCOX3在保持系和CMS系中的表達(dá)量如圖6所示。保持系9704B中，該基因在造孢細(xì)胞增殖期表達(dá)量最高，隨著小孢子的發(fā)育，其表達(dá)量不斷降低。CMS系9704A中，該基因在小孢子成熟期表達(dá)量最高，在小孢子發(fā)育的過程中花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期表達(dá)量最低，小孢子單核期、小孢子成熟期表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在兩系小孢子單核期，兩者之間的差異不明顯，在其他3個(gè)時(shí)期存在很大差異。在小孢子發(fā)育的造孢細(xì)胞增殖期，兩系存在差異顯著性，保持系是CMS系的6.4倍。在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期，保持系和CMS系的表達(dá)量接近6∶1，保持系明顯高于CMS系。在小孢子成熟期，CMS系高于保持系，是保持系的2倍。結(jié)果表明，在保持系和CMS系中，該基因的表達(dá)量存在較大差異，可能與雄性不育的形成有關(guān)。

圖3 辣椒與其他物種COX3氨基酸比對(duì)

圖4 辣椒與其他物種COX3氨基酸進(jìn)化樹分析

圖5 CaCOX3在9704B不同組織中的表達(dá)分析

圖6 9704A和9704B花蕾不同時(shí)期CaCOX3的表達(dá)分析

3 討論

線粒體呼吸鏈的最后一個(gè)酶是線粒體細(xì)胞色素c氧化酶，它將電子從細(xì)胞色素c驅(qū)動(dòng)到氧分子［18］。COX1、COX2和COX3是由線粒體基因組編碼的3個(gè)細(xì)胞色素c氧化酶的核心基因。研究表明，COX3在細(xì)胞色素c氧化酶中最保守，常用作物種分子系統(tǒng)演化和分類的有效基因［19］。在紅麻CMS系和保持系線粒體基因組研究中，COX3的組織形式在兩系中存在差異［20］。在粘類小麥CMS基因研究中，COX3在4種CMS系中的轉(zhuǎn)錄本小于保持系，推測(cè)基因可能參與粘類小麥CMS的形成［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，CaCOX3在花蕾的不同時(shí)期，保持系在造孢細(xì)胞增殖期、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的表達(dá)量遠(yuǎn)高于CMS系。根據(jù)目前研究，花粉敗育主要發(fā)生在單子葉植株小孢子成熟后期，雙子葉植物發(fā)生在四分體時(shí)期或小孢子發(fā)育時(shí)期［22］。辣椒是典型的雙子葉植物，在小孢子發(fā)育時(shí)，能量代謝發(fā)生改變，易造成不育現(xiàn)象的產(chǎn)生。CaCOX3作為呼吸作用中關(guān)鍵性基因，呼吸作用消耗有機(jī)物質(zhì)，釋放出能量用于植物的正常發(fā)育，保持系中該基因的表達(dá)量高，釋放出的能量多，而CMS系該基因表達(dá)量少，釋放出的能量少，因而造成了CMS系的小孢子不能正常生長發(fā)育，這可能是造成CMS的原因。在小孢子單核期，兩系之間該基因的表達(dá)量幾乎一致，但由于CMS系在小孢子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期能量不足，小孢子正常生長發(fā)育被打破，因而后期的能量是否充足，對(duì)小孢子能夠正常發(fā)育的意義不大。

4 結(jié)論

克隆獲得CaCOX3，其在辣椒胞質(zhì)雄性不育9704A和保持系9704B中表達(dá)量存在差異，可能引起能量代謝異常，造成雄性不育。