李樂(lè)，孫園

（1.新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2.石河子人民醫(yī)院，新疆 石河子 832002）

天山堇菜（Viola tianschanica Maxim）為堇菜科堇菜屬的全草，生于山坡草地、高山和亞高山草甸及水溝邊，海拔在3 000 m 以上，主要分布于新疆天山山脈。其氣微，味微苦辛，清熱解毒，具有調(diào)理、軟化、發(fā)汗的作用[1]。全草含黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、氨基酸、生物堿、黏液類(lèi)皂苷、鞣質(zhì)等物質(zhì)，具有廣泛的生物活性。其中黃酮類(lèi)有效成分對(duì)治療冠心病、老年癡呆、腦血栓及消除自由基、抑菌、抗癌等方面有顯著效果，目前市場(chǎng)已開(kāi)發(fā)出多種以黃酮為主要活性成分的藥品和保健食品[2-4]。課題組在天山堇菜的前期研究過(guò)程中，首次發(fā)現(xiàn)天山堇菜提取液能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，該功效可為天山堇菜的開(kāi)發(fā)提供更廣闊的思路。

涼茶，是藥茶、保健茶的一種。顧名思義，是指由藥性寒涼的藥物組成，“涼”即寒涼、苦涼、甘涼、辛涼，“茶”即茶葉。綜合起來(lái)，涼茶是用茶葉制成具有寒涼清熱、生津止渴作用的一種茶飲料，因其具有簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的特點(diǎn)，而為廣大群眾所接受。目前，主流涼茶產(chǎn)品中，都添加了蔗糖用以改善口感，這極大限制了涼茶在糖尿病人群中的應(yīng)用。結(jié)合天山堇菜的降糖效果，課題組選取天山堇菜提取液為主要成分，同時(shí)搭配涼茶產(chǎn)品中普遍使用的金銀花、野菊花、夏枯草、甘草和陳皮這5 種清熱中草藥。金銀花性甘寒氣芳香，用于各種熱性病，均效果顯著；野菊花可清熱解毒，疏風(fēng)散熱；夏枯草具有清肝、散結(jié)、利尿等作用；甘草是一種補(bǔ)益中草藥，有潤(rùn)肺、解毒、調(diào)和諸藥的功效；陳皮能健脾理氣[5]。涼茶中去除蔗糖改用其他甜味劑，制備出具有一定降糖效果的無(wú)糖涼茶，同時(shí)對(duì)天山堇菜涼茶工藝進(jìn)行考察，并對(duì)其口感和添加劑進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)將天山堇菜這一新疆特種植物加入到?jīng)霾璁?dāng)中，使得涼茶保留了原有清熱祛火的功效，適合更廣泛的人群使用。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-2041 紫外分光光度儀：日本島津公司；石英比色皿：宜興市晶科光學(xué)儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；BP211D 十萬(wàn)分之一電子分析天平：德國(guó)Sartorius；RE-201D 恒溫水油浴鍋：上海普渡生化科技有限公司，TP300 超聲波提取器：天鵬電子新技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 樣品與試劑

天山堇菜：新疆和田地區(qū)，經(jīng)石河子大學(xué)中藥系李鵬副教授鑒定為堇菜屬的天山堇菜全草；95 %乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；三氯化鋁：天津福晨化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市大陸化學(xué)試劑廠。以上均為分析純。

1.3 天山堇菜的提取工藝考察

在前期的試驗(yàn)基礎(chǔ)研究中，比較了回流提取法、索氏提取法及超聲提取法，以總黃酮為指標(biāo)進(jìn)行效果評(píng)價(jià)，結(jié)果表明回流提取效率最高，且操作簡(jiǎn)單，儀器易得，故選擇該方法作為提取工藝考察方法。

1.3.1 蘆丁對(duì)照溶液的制備

精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品20.54 mg，置25 mL 容量瓶中，加95%乙醇適量，超聲處理溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻即得。取對(duì)照品溶液0.5 mL 至10 mL 試管中，加入 5%NaNO3溶液 0.5 mL，搖勻，放置 5 min，加5%AlCl3溶液 0.5 mL，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH 溶液4 mL，加95%乙醇至10 mL，搖勻，放置10 min，以95%乙醇為空白參照，掃描吸收曲線(xiàn)，得在510 nm 處有最大吸收。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密量取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL 試管中，各加適量95%乙醇，采用硝酸鋁比色法測(cè)定，加入5%NaNO3溶液0.5 mL，搖勻，放置 5 min，加 5 % AlCl3溶液 0.5 mL，放置 6 min，加1 mol/L NaOH 溶液4 mL，加95%乙醇至10 mL，搖勻，放置10 min，以相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見(jiàn)分光光度測(cè)定方法，于510 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到標(biāo)準(zhǔn)方程A=1.428 7c + 0.008 6（R2= 0.995 2，濃度范圍0.082 16 mg/mL～0.657 29 mg/mL）。

1.3.3 不同提取溫度對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響

稱(chēng)取天山堇菜粉末2.0 g，以蒸餾水提取，固定料液比 1∶20（g/mL），回流提取時(shí)間 40 min，提取 1 次，提取溶液處理后測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中計(jì)算，最終得總黃酮含量。

1.3.4 不同料液比對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響

稱(chēng)取天山堇菜粉末2.0 g，蒸餾水提取，固定水浴溫度80 ℃，回流提取時(shí)間為40 min，提取1 次，考察料液比分別 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）時(shí)對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響。

1.3.5 不同提取次數(shù)對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響

稱(chēng)取天山堇菜粉末2.0 g，蒸餾水提取，固定料液比 1∶20（g/mL），回流提取時(shí)間 40 min，水浴溫度 80 ℃，考察提取 1 次、2 次、3 次、4 次、5 次對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響。

1.3.6 不同提取時(shí)間對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響

稱(chēng)取天山堇菜粉末2.0g，蒸餾水提取，固定提取溫度 80 ℃，料液比 1∶20（g/mL），提取 1 次，考察提取時(shí)間分別為 15、30、45、60、75min 時(shí)對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響。

1.3.7 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，稱(chēng)取天山堇菜2.0 g，根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)選的最佳提取條件，按照L9（34）正交表設(shè)計(jì)提取方案，以黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行正交優(yōu)化提取試驗(yàn)。

1.4 涼茶制備工藝

1.4.1 工藝流程

涼茶的主要制備工藝為：原料粉碎—提取—過(guò)濾—離心分離—調(diào)配—?dú)⒕?。基本操作步驟如下：原料用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)20 目篩得到的粉末，密封貯藏備用。以正交試驗(yàn)優(yōu)化后的提取工藝提取天山堇菜，抽濾，得到清液并冷卻[6]。將過(guò)濾后得到的清液置于3 000 r/min 的離心機(jī)中離心15 min，以分離清液中的殘?jiān)碗s質(zhì)。

1.4.2 茶提液制備

將野菊花、金銀花、夏枯草、陳皮、甘草按 3∶1∶1∶2∶2（質(zhì)量比）稱(chēng)取適量，加 50 倍水，95 ℃下浸提45 min，提取2 次。浸提液4 層紗布過(guò)濾，冷卻后置冰箱-4 ℃過(guò)夜，冷凍離心除“茶乳凝”等沉淀物，取上清液備用。

1.4.3 調(diào)配

按照天山堇菜提取液20%，茶提液30%的比例混合兩種提取液，并加入一定比例的木糖醇、麥芽糖醇、結(jié)晶山梨醇、穩(wěn)定劑、檸檬酸，充分溶解后加入等體積的水，再攪拌均勻[7]。

1.4.4 殺菌

在85 ℃～90 ℃熱水浴中保溫殺菌20 min，取出用自來(lái)水冷卻至室溫。

1.4.5 口感測(cè)試

口感測(cè)試選擇成年大學(xué)生志愿者50 人，男性與女性各25 人。氣味評(píng)分選擇有無(wú)不良?xì)馕稙橹笜?biāo)，分?jǐn)?shù)段1 分～10 分進(jìn)行打分，口感評(píng)分選擇黏稠感、甜味、腥味、苦澀感、清涼感5 項(xiàng)為指標(biāo)，各指標(biāo)1 分～10 分進(jìn)行打分后求均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將氣味評(píng)分與口感評(píng)分3∶7 的比例進(jìn)行評(píng)價(jià)，總分 10 分[8]。

1.4.6 甜味劑與檸檬酸的篩選

作為無(wú)糖食品的甜味劑，功能性糖醇應(yīng)為首選。結(jié)合木糖醇、麥芽糖醇、結(jié)晶山梨醇這3 種常用功能性甜味劑的特點(diǎn)和生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀，本試驗(yàn)選用木糖醇、麥芽糖醇為主甜味劑。木糖醇具有清爽純正的滋味，麥芽糖醇能使產(chǎn)品細(xì)膩，甜味可口，并延長(zhǎng)保存期，輔以結(jié)晶山梨醇可進(jìn)一步調(diào)節(jié)口感[9-10]。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行試驗(yàn)，并在殺菌后，進(jìn)行口感測(cè)試并評(píng)分。

1.4.7 穩(wěn)定劑的篩選

在飲料中使用穩(wěn)定劑，可以提高飲料的穩(wěn)定效果，但也有可能影響本涼茶的口感，在果膠、羧甲基纖維素（caboxy methyl cellulose，CMC）、黃原膠 3 種常用穩(wěn)定劑中篩選[11-12]，以口感評(píng)價(jià)。

1.5 天山堇菜涼茶安全性考察

為確保天山堇菜涼茶的飲用安全性，采用小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。選取SPF 級(jí)雄性昆明小鼠25 只，體重均為30 g 左右，并進(jìn)行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，測(cè)定血糖含量，采用優(yōu)化后方案制備涼茶，對(duì)其進(jìn)行灌胃處理，按照小鼠的體積計(jì)算給予小鼠灌胃20 d，末次給藥后禁食不禁水12 h 后尾部取血，用血糖儀測(cè)定血糖值。在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后檢測(cè)小鼠的體重的變化，每3 d 稱(chēng)取一次小鼠的體重并記錄數(shù)值，對(duì)小鼠體重的前后變化進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

考察提取溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃時(shí)對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

提取率由70 ℃開(kāi)始明顯提升，80 ℃達(dá)到最大值，90 ℃開(kāi)始下降。故選擇70、80、90 ℃為正交試驗(yàn)條件。

表1 提取溫度單因素考察表Table 1 Single factor study table of extraction temperature

2.2 料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

通過(guò)考察不同比例料液比對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 料液比單因素考察表Table 2 Single factor inspection table of Material-liquid ratio

提取率在料液比1∶10（g/mL）時(shí)開(kāi)始明顯提升，隨著料液比增大逐漸增大，1∶30（g/mL）之后提高較小，出于成本考慮選擇 1∶10、1∶20、1∶30（g/mL）3個(gè)水平為正交試驗(yàn)條件。

2.3 提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

考察不同提取次數(shù)對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 提取次數(shù)單因素考察表Table 3 Single factor study table of extraction numbers

隨著提取次數(shù)的增多，提取率增高，但3 次之后增高幅度不明顯，出于成本考慮選擇1 次、2 次、3 次為正交試驗(yàn)條件。

2.4 提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

考察不同提取時(shí)間對(duì)天山堇菜總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

隨著提取時(shí)間的增加，提取率增高，45 min 后增高幅度不明顯，故選擇15、30、45 min 為正交試驗(yàn)條件。

表4 提取時(shí)間單因素考察表Table 4 Single factor study table of extraction time

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

表5 天山堇菜提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 Factor table of orthogonal experiment of Viola tianschanica Maxim

表6 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 L9（34）Orthogonal test results

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，可以看出以上因素對(duì)天山堇菜中總黃酮提取率的影響優(yōu)先順序?yàn)锽＞D＞C＞A，提取率受料液比影響最大，天山堇菜總黃酮提取最佳工藝為A3B1C2D2，即提取溫度為90 ℃，料液比為1∶10（g/mL），提取次數(shù) 2 次，提取時(shí)間為 30 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

選取正交試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 組，得總黃酮平均提取率為1.21%，高于其余正交試驗(yàn)組。

2.7 甜味劑和檸檬酸的配比試驗(yàn)結(jié)果

確定天山堇菜涼茶中甜味劑和檸檬酸的配比，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表7。

表7 甜味劑和檸檬酸配比正交試驗(yàn)因素水平表Table 7 Factor table for orthogonal experiment of sweetener and citric acid ratio

通過(guò)L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定天山堇菜涼茶中甜味劑和檸檬酸的配比，試驗(yàn)效果以感官評(píng)定為標(biāo)準(zhǔn)，總分為10 分，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 糖酸比正交試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of sugar acid ratio orthogonal experiment

分析可知影響天山堇菜涼茶口感與滋味的主次因素順序?yàn)镃＞B＞A＞D，因此根據(jù)正交試驗(yàn)的優(yōu)選組合為A2B2C3D3。即每百毫升涼茶中加入天山堇菜提取液20 mL、茶提取液 30 mL、水 50 mL、木糖醇 3 g、麥芽糖醇3 g、檸檬酸0.08 g、結(jié)晶山梨醇1.5 g、為最優(yōu)方案，按照該工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，6 次口感測(cè)試評(píng)分和為56.8，證明該比例制備出的涼茶口感較好。

2.8 不同穩(wěn)定劑對(duì)于口感的影響

選擇3 種穩(wěn)定劑進(jìn)行口感評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 不同穩(wěn)定劑對(duì)口感影響Table 9 Effects of different stabilizers on taste

通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，確定天山堇菜涼茶中加入果膠可達(dá)到很好的外觀品質(zhì)與口感。

2.9 天山堇菜涼茶安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為確保天山堇菜涼茶的飲用安全性，采用小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 天山堇菜涼茶對(duì)正常小鼠影響情況Table 10 Influence of herbal tea on normal mice

實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)灌胃20 d 后，小鼠的進(jìn)食量與飲水量稍有增加，體重與血糖無(wú)明顯變化，無(wú)其他異常體征變化，20 d 期間小鼠全部存活，證明該涼茶產(chǎn)品對(duì)正常小鼠無(wú)毒副作用，對(duì)其正常血糖值不產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)天山堇菜的研究很少，其作為新疆的道地藥材有很多價(jià)值和潛力沒(méi)有發(fā)揮，其眾多的藥用和保健價(jià)值沒(méi)有被開(kāi)發(fā)。國(guó)內(nèi)針對(duì)天山堇菜的研究，主要對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，如總黃酮、多糖、鞣質(zhì)、微量元素等含量的研究，尚無(wú)食品、保健品方面的應(yīng)用，該植物的研究潛力還有待開(kāi)發(fā)，課題組在試驗(yàn)中，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了提取時(shí)間、液料比、溫度對(duì)天山堇菜總黃酮提取的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝，并利用優(yōu)化后的提取工藝得到天山堇菜提取液，同時(shí)通過(guò)口感測(cè)試，優(yōu)選出最佳糖酸比及穩(wěn)定劑的配方工藝，每百毫升涼茶中加入天山堇菜提取液20 mL、茶提取液30 mL、水 50 mL、木糖醇 3 g、麥芽糖醇 3 g、結(jié)晶山梨醇1.5 g、檸檬酸0.08 g，同時(shí)添加果膠0.1 g，制備出的涼茶具有良好的口感及外觀，將提取液作用于糖尿病小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了天山堇菜的降糖效果。這也是國(guó)內(nèi)首次在該植物研究中發(fā)現(xiàn)其降糖作用。結(jié)合其降糖功效及市面上涼茶產(chǎn)品的局限性，以天山堇菜為主要配方制備涼茶，并對(duì)其涼茶制備和配方進(jìn)行考察，得到了具有清香氣味，酸甜適口，清爽宜人的無(wú)糖涼茶，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該涼茶對(duì)正常血糖不產(chǎn)生影響，為該種植物未來(lái)的開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，也為新疆特種植物的研究與開(kāi)發(fā)提供有益參考。