單 靜，閆澤文，鄭思凡，王 恒，姜竹茂*

（煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005）

益生菌是一種通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡而對寄主機(jī)體施加有利影響的活的微生物[1-3]。近年來已相繼提出了食用含益生菌產(chǎn)品的多種益處，包括抗菌、抗誘變、抗癌和降高血壓以及降低血清膽固醇的含量、減輕乳糖不耐癥等，同時(shí)還可以減少過敏現(xiàn)象的發(fā)生[4-8]。而要想達(dá)到這些健康效應(yīng)，益生菌活菌數(shù)量是一個(gè)重要指標(biāo)[9-11]。羊奶作為一種比較獨(dú)特且又營養(yǎng)豐富的乳品資源，含有200多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，被稱為“奶中之王”[12-14]。隨著乳制品市場的不斷創(chuàng)新，多奶源、多種類將是未來乳業(yè)的發(fā)展趨勢，人們對羊奶制品需求也由最初的營養(yǎng)健康上升為保健功能，這無疑對羊奶發(fā)酵劑的質(zhì)量及種類提出了新的要求。針對羊奶凝乳性差、益生菌存活率低、有特殊氣味等問題，AHMED M等[15]從羊奶中分離出19種乳酸菌，通過對其進(jìn)行蛋白質(zhì)水解、感官和安全性檢測，篩選出菌株LbMS16、LbMS21和LbMF25作為羊奶制品的發(fā)酵劑；李串娜[16]通過對保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，篩選出適宜的凍干保護(hù)劑，對酸羊奶直投式發(fā)酵劑進(jìn)行了研究；葛萍等[17-18]通過對適于羊奶發(fā)酵的益生菌進(jìn)行篩選后，與基礎(chǔ)發(fā)酵劑YO-MIX883復(fù)配制成活菌數(shù)高、黏度大的羊奶飲料發(fā)酵劑。目前羊奶發(fā)酵劑在酸羊奶加工方面的研究較多，但鮮見關(guān)于益生菌在脫脂羊奶發(fā)酵基質(zhì)中生長特性的研究。因此，本研究以脫脂羊奶為發(fā)酵基質(zhì)，篩選出適宜羊奶發(fā)酵的菌種，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，將羊奶的營養(yǎng)功能和益生菌的保健功能有機(jī)結(jié)合，以期開發(fā)出一款產(chǎn)酸能力強(qiáng)和活菌數(shù)高的復(fù)配益生菌發(fā)酵劑，對益生菌羊奶飲料的開發(fā)具有較好的理論及實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）LC-01：丹麥科漢森有限公司；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）LAFTT-L10：帝斯曼（DSM）中國有限公司；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）LPc-G110、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Lp-G18：潤盈生物工程（上海）有限公司；長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）CICC6187：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；羊奶：煙臺某養(yǎng)殖場。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL，pH 6.2～6.6，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CRJ-0.03/60型均質(zhì)機(jī)：廊坊成瑞機(jī)械設(shè)備有限公司；FA1004型電子天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司；EM-30型磁力攪拌水浴鍋：常州人和儀器廠；DNP-9082型電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZM-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；9N100型碟式牛奶分離機(jī)：青海農(nóng)牧機(jī)械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊奶發(fā)酵劑的加工工藝流程

羊奶脫脂→均質(zhì)（65℃、20 MPa）→熱處理（115℃、15 min）→冷卻（37℃左右）→接種→單菌培養(yǎng)→篩選→復(fù)配培養(yǎng)→發(fā)酵劑

1.3.2 羊奶發(fā)酵劑加工操作要點(diǎn)

（1）脫脂羊奶的制備

利用碟式牛奶分離機(jī)將羊奶進(jìn)行脫脂處理，控制含脂率≤0.5%，因?yàn)檠蚰讨泻械挠坞x脂肪酸會抑制益生菌的增殖，影響發(fā)酵劑菌種的培養(yǎng)及篩選。

（2）接種：稱取益生菌各1 g，分別投放于99 mL的滅菌脫脂羊奶中，搖勻，制成菌含量為1%的接種菌液，發(fā)酵接種量以接種的脫脂乳體積計(jì)算[19]。

（3）單菌培養(yǎng)：將干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，長雙歧桿菌置于厭氧培養(yǎng)罐中再放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

（4）篩選：選擇產(chǎn)酸能力強(qiáng)、活菌數(shù)高的菌種進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵篩選試驗(yàn)。

（5）復(fù)配培養(yǎng)：根據(jù)菌株間的共生調(diào)節(jié)機(jī)制，將干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、副干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌分別以2∶1復(fù)配，在37℃的恒溫條件下厭氧培養(yǎng)72 h，得發(fā)酵劑。

1.3.3 益生菌的篩選及復(fù)配試驗(yàn)

（1）益生菌種類對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響

以滅菌脫脂羊奶為發(fā)酵基質(zhì)，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、長雙歧桿菌為試驗(yàn)對象，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量為4%，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h的條件下，每隔6 h測定一次不同益生菌發(fā)酵液的酸度、pH值和活菌數(shù)[20]，對12組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、活菌數(shù)高的菌種進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵試驗(yàn)研究。

（2）不同復(fù)配益生菌對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響

在單菌種發(fā)酵試驗(yàn)菌種的基礎(chǔ)上，以及根據(jù)益生菌的共生調(diào)節(jié)機(jī)制，將干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、副干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌分別以2∶1復(fù)配，接種量為4%，在37℃的恒溫條件下厭氧培養(yǎng)72h。試驗(yàn)過程中每隔6 h測定一次不同復(fù)配菌種在生長穩(wěn)定期（益生菌活菌數(shù)基本保持不變時(shí)）的最大活菌數(shù)，篩選出最佳益生菌組合。

（3）復(fù)配益生菌比例對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響

將干酪乳桿菌與長雙歧桿菌以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2（V/V）混合，按4%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，在37℃條件下培養(yǎng)至菌種生長穩(wěn)定期，測定其發(fā)酵酸度和活菌數(shù)，確定最佳復(fù)配比例。

1.3.4 復(fù)配益生菌發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）接種量對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響

復(fù)配益生菌按照2%、3%、4%、5%、6%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，在37℃條件下發(fā)酵至益生菌生長穩(wěn)定期，測定其發(fā)酵酸度和活菌數(shù)，確定復(fù)配益生菌的最佳接種量。

（2）發(fā)酵溫度對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響

復(fù)配益生菌按照4%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，分別在35℃、36℃、37℃、38℃、39℃條件下發(fā)酵至益生菌生長穩(wěn)定期，測定其發(fā)酵酸度和活菌數(shù)，確定復(fù)配益生菌的最佳發(fā)酵溫度。

（3）發(fā)酵時(shí)間對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響

復(fù)配益生菌按照4%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，在37℃條件下發(fā)酵至菌種生長衰亡期（益生菌活菌數(shù)逐漸降低時(shí)），每隔6 h測定一次發(fā)酵酸度和活菌數(shù)，確定復(fù)配益生菌的最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5 復(fù)配益生菌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以益生菌活菌數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得出最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 復(fù)配益生菌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of compound probiotics

1.3.6 分析檢測

酸度的測定參照GB5009.239—2016《食品酸度的測定》中酚酞指示劑法；pH值的測定用pH計(jì)測量3次，取其平均值；益生菌活菌數(shù)的測定參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》中MRS平板計(jì)數(shù)法。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，采用SPSS20.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌種類對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響

圖1 單菌發(fā)酵滴定酸度和pH值（A）與活菌數(shù)（B）隨時(shí)間變化曲線Fig.1 Change curves of titration acidity,pH(A)and viable bacteria count(B)during single bacterium fermentation process

在脫脂羊奶發(fā)酵過程中，不同益生菌產(chǎn)酸能力及生長曲線均有一定的差別，這不僅與益生菌本身的發(fā)酵特性有關(guān)，也與其發(fā)酵介質(zhì)有關(guān)[21]。由圖1可知，干酪乳桿菌在生長穩(wěn)定期最高活菌數(shù)達(dá)到6.19×108CFU/mL，顯著高于其他幾組菌（P＜0.05），雖然在發(fā)酵后期活菌總數(shù)下降，但是發(fā)酵基質(zhì)中的乳糖還沒有消耗完，益生菌仍可以利用其作為能量來源物質(zhì)生成乳酸[22]。因此，活菌基數(shù)越大，活菌下降速度越慢，產(chǎn)生的乳酸也就越多，滴定酸度也越高。5種菌種產(chǎn)酸能力最大的是干酪乳桿菌，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)滴定酸度達(dá)到（194.26±0.89）°T，而副干酪乳桿菌為（185.53±1.03）°T，嗜酸乳桿菌為（172.59±0.79）°T，植物乳桿菌為（148.18±0.51）°T，長雙歧桿菌為（161.54±0.94）°T。而嗜酸乳桿菌在發(fā)酵初期，產(chǎn)酸速度較快，明顯高于其他4種菌。并且滴定酸度要滯后于pH值，主要由于pH值的大小不僅取決于酸的數(shù)量和性質(zhì)，而且還受到發(fā)酵基質(zhì)中緩沖物質(zhì)的影響[23]。此外，5種益生菌在發(fā)酵48h之后產(chǎn)酸量逐漸趨向平穩(wěn)。結(jié)果表明，干酪乳桿菌在發(fā)酵初期產(chǎn)酸速度相對較慢，但是其產(chǎn)酸周期最長，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，生長穩(wěn)定期的活菌數(shù)最高。

2.2 復(fù)配益生菌對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響

復(fù)配益生菌對脫脂羊奶中活菌數(shù)的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，各復(fù)配菌種在穩(wěn)定期的最大活菌數(shù)差異較大。并且復(fù)配菌種的最大活菌數(shù)要明顯高于其單菌種發(fā)酵的最大活菌數(shù)，所以當(dāng)復(fù)配菌種存在共生機(jī)制時(shí)可以提高發(fā)酵基質(zhì)中的活菌數(shù)，進(jìn)而提高發(fā)酵效率[17]。其中干酪乳桿菌和長雙歧桿菌在3種復(fù)配益生菌組合中的增菌效果最好，在生長穩(wěn)定期的最大活菌數(shù)為8.89×108CFU/mL。雖然嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）混合發(fā)酵時(shí)，較其他2組菌最先達(dá)到生長穩(wěn)定期，但其復(fù)配組合的增菌效果（8.26×108CFU/mL）以及到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間明顯低于干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）。因?yàn)檩^高的活菌數(shù)和適宜的發(fā)酵時(shí)間有利于后期加工過程中獲得足夠的發(fā)酵酸度、風(fēng)味物質(zhì)以及提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。副干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）與干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）復(fù)配組合具有相似的生長趨勢，但增菌效果顯著低于其他2組（P＜0.05）。此外，干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）復(fù)配組合的最大活菌數(shù)與葛萍[17]研究的副干酪乳桿菌（LP01）和YO-MIX883組合相比高近40%，可能與發(fā)酵基質(zhì)的成分或菌種特性有關(guān)。因此，選擇干酪乳桿菌和長雙歧桿菌混合菌發(fā)酵脫脂羊奶較為合適。

圖2 復(fù)配益生菌活菌數(shù)隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Change curve of viable compound probiotics count with time

2.3 益生菌復(fù)配比例對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響

益生菌復(fù)配比例對脫脂羊奶發(fā)酵性能的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著干酪乳桿菌與長雙歧桿菌接種比例的減小，發(fā)酵基質(zhì)中的活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明了干酪乳桿菌與長雙歧桿菌存在良好的共生關(guān)系，適當(dāng)接種長雙歧桿菌有利于增加發(fā)酵基質(zhì)中的活菌數(shù)，提高發(fā)酵效率以及縮短發(fā)酵凝乳時(shí)間。滴定酸度隨著接種比例的變化呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，由于干酪乳桿菌的產(chǎn)酸能力優(yōu)于長雙歧桿菌，因此，隨著干酪乳桿菌接種比例的減小，滴定酸度隨之降低。綜合考慮益生菌的活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力，因此選擇干酪乳桿菌和長雙歧桿菌的最佳復(fù)配比為3∶1。

圖3 干酪乳桿菌和長雙歧桿菌接種比例對益生菌活菌數(shù)和滴定酸度的影響Fig.3 Effect ofLactobacillus caseiandBifidobacterium longum inoculation ratio on viable probiotics count and titration acidity

2.4 復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.4.1 接種量對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響

接種量對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響結(jié)果見表2。在發(fā)酵過程中發(fā)酵劑接種量會直接影響發(fā)酵基質(zhì)中益生菌的存活率。當(dāng)發(fā)酵劑接種量較少時(shí)，發(fā)酵速度緩慢。而當(dāng)發(fā)酵劑接種量過大時(shí)，菌種產(chǎn)酸速度加快，并隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌種由穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，菌體易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，再加上酸度對菌體的抑制作用隨著酸度的增大越發(fā)明顯[24-25]，致使益生菌活菌數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢。菌種的發(fā)酵性能除了受外部生長環(huán)境的影響，還與自身生理特性有關(guān)，從而抑制益生菌的生長繁殖，使發(fā)酵基質(zhì)中活菌數(shù)降低。由表2可知，隨著益生菌接種量增加，滴定酸度逐漸增大，并且pH值隨之降低。其中當(dāng)接種量為4%時(shí)，脫脂羊奶基質(zhì)中益生菌在穩(wěn)定期的最大活菌數(shù)最高，并且顯著高于接種量為2%、3%、5%和6%（P＜0.05），考慮生產(chǎn)成本的節(jié)約及較高的活菌數(shù)發(fā)酵條件，選擇復(fù)配益生菌發(fā)酵劑的接種量4%為最佳。

表2 接種量對發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響Table 2 Effect of inoculum on fermentation performance of starter

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響

發(fā)酵時(shí)間對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵基質(zhì)中的滴定酸度和益生菌活菌數(shù)都有逐漸增大趨勢，而發(fā)酵后期，酸度趨于平穩(wěn)狀態(tài)，益生菌活菌數(shù)由于受到發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境的影響呈現(xiàn)下降的趨勢。在發(fā)酵時(shí)間為48～54 h時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)中益生菌活菌數(shù)達(dá)到最大，顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間。在發(fā)酵初期，菌種處于適應(yīng)期，生長速度緩慢，隨后菌體進(jìn)入對數(shù)期，生長繁殖較快，發(fā)酵基質(zhì)中活菌數(shù)増加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，益生菌分解乳糖產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵基質(zhì)的滴定酸度升高，從而抑制了菌種自身的生長，造成活菌數(shù)的下降。因此，選擇54 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵劑滴定酸度及活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the titration acidity and viable probiotics count of starter

2.4.3 發(fā)酵溫度對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響

發(fā)酵溫度對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響結(jié)果見表3。由表3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵基質(zhì)中酸度和活菌數(shù)變化顯著（P＜0.05），而pH變化不顯著（P＞0.05）。當(dāng)復(fù)配發(fā)酵劑在37℃發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)中益生菌活菌數(shù)明顯高于其他幾組。由于發(fā)酵溫度與菌種代謝活動(dòng)密切相關(guān)，在最適溫度下代謝旺盛，菌體生長較快。并且不同的菌種有其適宜生長溫度，在此溫度下發(fā)酵基質(zhì)中益生菌活菌數(shù)較高，同時(shí)也具有較強(qiáng)的耐酸性，能夠抵抗發(fā)酵過程中乳酸的影響。因此，從益生菌發(fā)酵方面來看，復(fù)配益生菌發(fā)酵劑在37℃條件下發(fā)酵有利于益生菌的生長繁殖。

表3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵劑發(fā)酵性能的影響Table 3 Effect of fermentation temperature on fermentation performance of starter

2.5 復(fù)配益生菌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以益生菌活菌數(shù)為考察指標(biāo)，選擇接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為影響因素進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其結(jié)果與分析見表4。

表4 復(fù)配益生菌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation condition optimization of compound probiotics

由表4可知，極差R越大，表示該因素對指標(biāo)的影響越大，因此，各因素對復(fù)配益生菌活菌數(shù)的影響大小為發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞發(fā)酵溫度，最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A2B2C2，即接種量4%，發(fā)酵時(shí)間為54 h，發(fā)酵溫度為37℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，益生菌的最大活菌數(shù)為9.59×108CFU/mL，滴定酸度為198.56 °T。

3 結(jié)論

在脫脂羊奶為發(fā)酵基質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過探究干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌等單菌的最大活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力，并根據(jù)菌種間的共生調(diào)節(jié)機(jī)制，篩選出適于脫脂羊奶發(fā)酵的復(fù)配益生菌組合。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步對復(fù)配益生菌發(fā)酵劑的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，即復(fù)配益生菌組合為干酪乳桿菌和長雙歧桿菌，復(fù)配比為3∶1，接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間54 h，發(fā)酵溫度37℃。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，最大活菌數(shù)可達(dá)9.59×108CFU/mL，酸度為198.56°T，與其他適用于羊奶發(fā)酵劑的發(fā)酵性能相比，干酪乳桿菌和長雙歧桿菌復(fù)配組合可以賦予羊奶基質(zhì)足夠的發(fā)酵酸度、風(fēng)味物質(zhì)和活菌數(shù)，為益生菌羊奶飲料的開發(fā)奠定了良好的實(shí)踐意義。