劉博，趙建國，夏愛輝，唐晶，劉洋，李永峰，劉俊

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 胃腸外科，湖北 武漢 430022）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)病死率中排第3位[1-2]。胃癌患者在發(fā)現(xiàn)時往往已是晚期，導(dǎo)致預(yù)后不佳[3]。由Wnt家族分泌的糖蛋白觸發(fā)的信號通路在進化上相對保守，參與細胞增殖、分化調(diào)控[4]。Wnt7a是Wnt家族的一員，廣泛表達于人體各種器官，包括肺、睪丸、淋巴結(jié)和腦等[5]。Wnt7a與腫瘤的關(guān)系已有報道，如腫瘤細胞分泌的Wnt7a能招募并激活腫瘤相關(guān)成纖維細胞營造適合腫瘤生長的微環(huán)境，從而促進腫瘤生長及惡性進展[6]。Wnt7a能夠激活Wnt信號通路，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白（β-catenin）入核增加，從而促進膀胱癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[7]。在子宮內(nèi)膜癌中，Wnt7a高表達于腫瘤組織中，并與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管浸潤等惡性表型密切相關(guān)，高表達Wnt7a的子宮內(nèi)膜癌患者更易復(fù)發(fā)，生存預(yù)后更差[8]。與之相反，Wnt7a的抑癌功能在其他腫瘤中也有報道，如在雌激素受體陽性的乳腺癌中，多因素分析發(fā)現(xiàn)Wnt7a低表達與乳腺癌患者預(yù)后差相關(guān)[9]。然而，Wnt7a在胃癌中的表達及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系并不清楚。本文通過檢測Wnt7a在胃癌組織中的表達，分析Wnt7a表達與胃癌患者臨床病理因素間的關(guān)系及對預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2009年1月—2014年12月在華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院行胃癌根治術(shù)后標本135例，其中乳頭狀腺癌75例，管狀腺癌45例，低分化腺癌15例。納入標準：⑴ 術(shù)前未經(jīng)放化療治療；⑵ 行胃癌根治性切除術(shù)，并經(jīng)病理醫(yī)師確診；⑶ 有詳細完整的病例及隨訪資料。剔除標準：⑴ 臨床病例或隨訪資料不全者；⑵ 合并其他腫瘤者。隨訪時間截止至2018年3月，共得到胃癌標本135例，分別做成石蠟標本，并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

總蛋白提取試劑試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、山羊抗小鼠HRP偶聯(lián)標記的二抗、GAPDH小鼠抗人單克隆抗體均購于成都正能生物技術(shù)有限公司；Wnt7a小鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；即用型免疫組化MaxVisionTM試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 Western blot法

組織蛋白提取采用總蛋白提取試劑盒按說明書進行。按取0.1 g凍存的組織標本經(jīng)研磨后加入0.5 mL裂解液（加蛋白酶抑制劑）行冰上裂解1 h，4 h液（加蛋白酶抑離心10 min），吸取上清得到總蛋白提取液。BCA法測定蛋白濃度，將樣品作適當(dāng)稀釋后加20 μL到96孔板的樣品孔中，各孔加入200 μL樣品孔中，各工作液，37 ℃放置1 h。用酶標儀測定A562 nm吸光度，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品加入等體積2×電泳加樣緩沖液煮沸10 min。經(jīng)10%濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳轉(zhuǎn)印到PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉30 min，加入一抗Wnt7a（1:300）或者GAPDH（1:500）4 ℃過夜孵育，PBST漂洗3次。室溫孵育HRP標記的二抗（1:1 000）2 h，漂洗3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。

1.4 免疫組化

免疫組化實驗步驟按免疫組化試劑盒步驟進行。石蠟切片于65 ℃烘片2 h，二甲苯和酒精常規(guī)脫蠟至水。3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶30 min。檸檬酸鈉緩沖液微波加熱至沸騰抗原修復(fù)5 min，漂洗3次。5%山羊血清封閉30 min后去除多余液體，加Wnt7a一抗（1:200）4 ℃孵育過夜，漂洗3次。加二抗（1:500）室溫孵育1 h，漂洗3次。DAB顯色試劑顯色，當(dāng)目標蛋白出現(xiàn)棕黃色時自來水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染細胞核。根據(jù)顯色深淺及陽性細胞百分比分級，Wnt7a表達強度采用組織學(xué)評分（陽性細胞百分比：0為沒有細胞顯色或陽性細胞百分數(shù)＜5%；1為5%～35%細胞顯色；2為36%～65%細胞顯色；3代表＞66%細胞顯色。表細胞染色強度：0為不顯色；1為淺黃色；2為棕黃色；3為深褐色?？偡帧萆罘譃楦弑磉_組，＜5分為低表達組）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計處理采用獨立t檢驗對組間進行比較；計數(shù)資料采用χ2檢驗?；颊呖偵媛屎蜔o瘤生存率均采用Kaplan-Meier分析，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型，統(tǒng)計顯著性以P＜0.05為標準。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，胃癌組織中的Wnt7a蛋白表達量在明顯高于癌旁組織（圖1）。

圖1 Western blot檢測Wnt7a蛋白表達Figure 1 Determination of Wnt7a protein expression by Western blot

2.2 免疫組化檢測結(jié)果

Wnt7a低表達于癌旁組織中，染色強度較淺（圖2A）；Wnt7a在胃癌組織中染色強度深，同時在胃癌組織中Wnt7a的表達也存在差異，部分胃癌組織中低表達Wnt7a（圖2B），部分胃癌組織高表達Wnt7a，染色強度深，主要定位在細胞質(zhì)，胞外也著色（圖2C）。胃癌組織Wnt7a低表達40例（29.6%），高表達95例（70.4%）， 癌旁組織Wnt7a低表達130例（96.3%），高表達5例（3.7%），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.5，P=0.00）。

圖2 免疫組化檢測Wnt7a蛋白表達（×100）Figure 2 Immunohistochemical staining for Wnt7a protein expressions (×100)

2.3 Wnt7a表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，Wnt7a表達水平與胃癌患者性別、年齡、HP感染、分化程度和Lauren分型無明顯關(guān)系（均P＞0.05），而與胃癌患者TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)（均P＜0.05）（表1）。

表1 Wnt7a表達與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系Table 1 The relations of Wnt7a expression with clinicopathologic characteristics in gastric cancer patients

圖3 Wnt7a高低表達組與低表達組生存曲線Figure 3 The survival curves of groups of Wnt7a high and low expression

2.4 Wnt7a表達水平與胃癌患者無瘤生存率和總生存率的關(guān)系

Wnt7a高表達組1年無瘤生存率為70.5%，Wnt7a低表達組為83.6%；Wnt7a高表達組5年無瘤生存率為3.6%，Wnt7a低表達組為47.4%，Wnt7a高表達組1、5年無瘤生存率低于Wnt7a低表達組（均P＜0.01）（圖3A）；Wnt7a高表達組1年總生存率為78.1%，Wnt7a低表達組為85.1%；Wnt7a高表達組5年總生存率為17.2%，Wnt7a低表達組為60.9%，Wnt7a高表達組1、5年總生存率低于Wnt7a低表達組（均P＜0.01）（圖3B）。

2.5 影響胃癌患者無瘤生存率的危險因素

單因素分析示：TNM分期（P=0.01）、遠處轉(zhuǎn)移（P＜0.01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.04）及Wnt7a表達（P=0.02）為影響胃癌患者無瘤生存率的因 素，多因素分析示：遠處轉(zhuǎn)移（P=0.02）及Wnt7a表達（P=0.01）為影響胃癌患者無瘤生存率的獨立危險因素（表2）。

2.6 影響胃癌患者總生存率的危險因素分析

單因素分析示：TNM分期（P=0.04）、遠處轉(zhuǎn)移（P＜0.01）及Wnt7a表達（P＜0.01）為影響胃癌患者總生存率的因素，多因素分析示：TNM分期（P=0.03）、遠處轉(zhuǎn)移（P＜0.01）及Wnt7a表達（P=0.02）為影響胃癌患者總生存率的獨立危險因素（表3）。

表2 單因素及多因素分析胃癌患者無瘤生存相關(guān)危險因素Table 2 The risk factors for disease-free survival analyzed by univariate and multivariate analyses

表3 單因素及多因素分析胃癌患者總生存相關(guān)危險因素Table 3 The risk factors for overall survival analyzed by univariate and multivariate analyses

3 討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，每年約有100萬例新胃癌病例被確診，約70萬例死亡，占全球癌癥相關(guān)病死率的10%，已經(jīng)構(gòu)成嚴重的公共衛(wèi)生安全問題[2]。胃癌的無進展生存和預(yù)后高度依賴于胃癌的早期診斷，其高病死率與缺乏標準篩查和早期癥狀缺乏相關(guān)。因此，胃癌早期診斷生物標志物的鑒定對治療胃癌至關(guān)重要。

Wnt信號通路家族成員是由WNT基因編碼一類高度保守的分泌型糖蛋白，通過與卷曲受體結(jié)合，調(diào)控細胞死亡、增殖、分化[10]。Wnt7a已被證實在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，如再生[11]、干細胞擴增[12]及惡性轉(zhuǎn)變[13]等。Wnt7a在不同腫瘤中的表達狀態(tài)存在較大差異。在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)現(xiàn)Wnt7a與腫瘤患者的總生存時間和無瘤生存時間顯著相關(guān)，單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，Wnt7a的表達可作為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的風(fēng)險因子[8]。在卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)，相對于癌旁組織，Wnt7a在卵巢癌組織中高表達，并與患者預(yù)后差相關(guān)[14]。在結(jié)腸癌中，Wnt7a高表達于結(jié)腸癌組織中，并與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。Wnt7a高表達的腫瘤患者無瘤生存時間和總生存時間更短[15]。除了Wnt7a所為癌基因有文獻報道外，其作為抑癌基因也有文獻報道。如在宮頸癌組織和細胞系中，Wnt7a呈低表達狀態(tài)[16]。Bikkavilli 等[17]在轉(zhuǎn)基因鼠中發(fā)現(xiàn)，小鼠肺癌發(fā)病率升高，主要由于Wnt7a缺失表達。在白血病中[18]，發(fā)現(xiàn)Wnt7a在白血病中低表達，高表達Wnt7a的T淋巴細胞能夠抑制白血病細胞增殖，說明Wnt7a具有抑制腫瘤的功能。在腎細胞癌[19]中，88%的Wnt7a呈低表達狀態(tài)，且過表達Wnt7a可抑制腫瘤細胞增殖和克隆形成能力。在本研究中，胃癌組織Wnt7a高表達。結(jié)合臨床病理因素分析發(fā)現(xiàn)，Wnt7a高表達與TNM分期、遠處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，這與之前在乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中的報道一致。生存分析發(fā)現(xiàn)，Wnt7a高表達的胃癌患者更易復(fù)發(fā)，生存時間更短。多因素分析提示W(wǎng)nt7a的表達狀態(tài)可作為預(yù)測患者預(yù)后的獨立危險因素。

當(dāng)然，本研究僅限于分析胃癌患者臨床病理因素與Wnt7a表達水平的關(guān)系，對機制并未作深入研究。Wnt7a在不同腫瘤中表達狀態(tài)存在差異，在機制研究方面，在宮頸癌組織和細胞系中，Wnt7a下調(diào)表達的原因是由于其啟動子中CpG島的甲基化所致[16]。結(jié)合已有的報道，腫瘤中低表達的原因可能是由于表觀遺傳修飾調(diào)控，比如啟動子DNA的甲基化、mRNA被微小RNA降解等，從而導(dǎo)致細胞衰老和凋亡不受調(diào)控，進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。Wnt7a作為抑癌基因的機制方面，Bikkavilli等[17]發(fā)現(xiàn)，Wnt7a通過失活調(diào)控細胞衰老的重要調(diào)控因子S期蛋白激酶相關(guān)蛋白2的活性，從而調(diào)控細胞正常衰老和凋亡，一旦WNT7A的表達量異常降低，這一過程被干擾，細胞衰老和凋亡減少，進而導(dǎo)致小鼠肺癌的發(fā)生。Wnt7a作為癌基因的機制方面，King等[20]發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子1作為Wnt7a/β-catenin信號通路下游的直接靶分子促進腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)Wnt7a的高表達與胃癌的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。筆者推測Wnt7a可能參與了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)合之前的報道，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而Wnt7a/β-catenin信號通路能夠促進胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，從而促進胃癌轉(zhuǎn)移[21-23]。因此，推測Wnt7a上調(diào)表達可能通過促進胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致胃癌的遠處轉(zhuǎn)移。

綜上，Wnt7a在胃癌組織中高表達，并與患者惡性病理特征和預(yù)后差相關(guān)。Wnt7a的表達可作為判斷胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因子。誠然，本研究也存在一定的不足，比如Wnt7a在細胞系中的結(jié)果如何，與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子作用機制還有待后續(xù)深入研究。