文宇，張子建，顏世超，劉翔，周江蛟，熊力，李清龍

（中南大學湘雅二醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410011）

結直腸癌是世界上第三大常見惡性腫瘤。盡管不斷努力預防和改進治療，其預后仍很差，大約35%～40%的局部進展期直腸癌患者最終會發(fā)生遠處轉移并死亡[1]，該病病死率與肝臟轉移的發(fā)生密切相關。結直腸癌的動物模型是研究結直腸癌發(fā)生和發(fā)展機制實驗物質基礎。因此，通過動物模型研究結直腸癌肝轉移的機制是控制疾病進展的重要研究手段。目前人們已在體外和體內開發(fā)了肝轉移模型。體外轉移模型易于操作，廉價且可重復。這些模型允許操縱轉移過程中的每個步驟，但是對整個轉移過程的綜合分析存在局限性[2-3]。相反， 使用動物的體內轉移模型可以更準確地代表轉移過程并且可以模擬人體癌癥進行相應的基因操作。然而，它們也存在著相關的倫理問題和經濟負擔[4-6]。目前，已經開發(fā)了許多動物模型用于評估肝轉移的機制和建立治療策略[4-9]。這些臨床前研究提供了與臨床應用相關的證據，并且有助于改善具有肝轉移的結腸直腸癌患者的存活。本文就目前用于結直腸癌肝轉移的小鼠模型綜述如下。

1 小鼠結直腸模型的類型

目前小鼠模型是腫瘤轉移研究中應該最廣泛的動物模型。小鼠相比其他動物在實驗動物學上具有許多優(yōu)勢，小鼠基因組與人類基因組高度同源，在解剖和生理上具有相似性。小鼠的繁殖能力強，生殖周期短，飼養(yǎng)相對簡單，體積小，十分有利于進行大規(guī)模的實驗。小鼠結直腸癌肝轉移動物模型類型總結為圖1。

圖1 小鼠結直腸癌肝轉移模型的類型Figure 1 Types of mouse models of CRC liver metastasis

1.1 按腫瘤發(fā)生的角度分類

從腫瘤發(fā)生的角度出發(fā)，總的說可以分為三大類型：化學誘導模型、基因工程模型和種植模型。化學誘導模型是指讓小鼠暴露在化學致癌物下，使其自發(fā)形成癌癥或者轉移的模型。基因工程模型通過基因組表達的改變而建立，例如癌基因的激活和抑癌基因的失活。種植模型是將來自人（異種）或鼠（同種異體）的移植物植入荷瘤小鼠體內的模型。

1.2 按移植物的種屬分類

移植物的種屬和是否 保留的腫瘤異質性決定選擇什么免疫活性的小鼠，通常有兩種選擇：在具備免疫活性的小鼠中移植同種異體移植物和在免疫缺陷小鼠中移植異種移植物。在具備免疫活性的小鼠中移植同種異體移植物的方法對于評估腫瘤與其微環(huán)境之間的相互作用有較大意義，移植物很少排斥，它們具有經濟效益和方便性，然而這些模型不能反映人類腫瘤的遺傳異質性。在免疫缺陷小鼠中移植異種移植物的方法盡管存在諸如免疫系統(tǒng)功能缺陷和移植成功率低的局限性，但是隨著精準醫(yī)療的興起，是否能夠反應人類腫瘤異質性尤為重要，因此異種移植在人類腫瘤研究中也得到了廣泛的應用，目前常見的異種移植模型有細胞系、類器官和病人源腫瘤移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）[10]。將人結腸直腸癌細胞原位或者異位注射到免疫缺陷小鼠中通常會導致注射部位的腫瘤生長，常用的小鼠品系包括裸鼠（無胸腺）和嚴重聯合免疫缺陷（SCID）小鼠。自2010年初以來，種植類器官的技術迅速發(fā)展，類器官是體外三維形成的器官的小型化和簡化版，Matano等[11]使用CRISPR/Cas9技術編輯人結直腸癌類器官的APC，TP53，SMAD4，KRAS和/或PIK3CA等基因，然后用以上基因工程化的類器官建立腎被膜移植和實驗性肝轉移的小鼠模型，結果顯示基因工程化的類器官成功在肝臟定植。PDX模型是將手術期間獲得患者腫瘤組織的部分并植入免疫缺陷小鼠，一旦腫瘤生長就將其取出植入其他小鼠進行傳代，此后重復這一過程，直到獲得足夠的動物用于實驗。PDX模型受到越來越多的關注，它能反映每一位患者的腫瘤異質性，可用于個性化用藥指導、藥效篩選和生物標志物的開發(fā)等。

1.3 按結直腸癌肝轉移的建立角度分類

從肝 轉移的建立角度出發(fā)，可分為自發(fā)性轉移模型和實驗性轉移模型。目前，采用結直腸癌細胞系或者腫瘤組織移植到小鼠中建立結直腸癌肝轉移動物模型是最為常見的造模方法。自發(fā)性肝轉移模型就是采用上述方法，在不經過其他干預下經腫瘤自由生長后發(fā)生轉移的模型；而實驗性轉移模型則是人為通過靜脈、脾臟或其他部位注射腫瘤細胞模擬血道轉移的模型，具體見后文。

2 化學誘導性模型、基因工程模型和PDX模型：完整腫瘤微環(huán)境的分歧

由 于腫瘤微環(huán)境對腫瘤進展具有十分重要的作用，因此在有免疫活性的小鼠中建立結直腸癌肝轉移模型很有必要。有免疫活性的動物表現出的健康狀態(tài)通常更穩(wěn)定，其完整的免疫系統(tǒng)可用于測試免疫療法的效果，而且將免疫機制作為癌癥的治療靶點進行研究已成為熱點之一。在有免疫活性的小鼠中通過化學致癌物誘導和基因工程技術可以滿足在原發(fā)部位形成完整腫瘤微環(huán)境的特點，但其并不能體現腫瘤異質性。而PDX模型雖然克服了前兩者缺乏腫 瘤異質性的缺點，但是免疫系統(tǒng)受損，缺乏免疫細胞的參與，腫瘤微環(huán)境不完善。

2.1 化學誘導模型

自發(fā)和致癌物誘導的結直腸癌的小鼠模型是最早有相關報道的模型。小鼠自發(fā)形成結 直腸癌的發(fā)生率為1%[12-13]，因此無法對結直腸癌的進展進行有效地實驗研究。為了增加結直腸癌的發(fā)病率，將小鼠暴露于致癌物下，大多數致癌物質會引起多個器官的惡性腫瘤，但有些會主要誘發(fā)結直腸癌。經常使用的致癌物質有二甲肼（dimethylhydrazine，DMH）及其代謝產物氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM），雜環(huán)胺（Heterocyclic amines，HCAs），甲基硝基亞硝基胍（N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）和甲基亞硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）[14]。研究[15-16]通過皮下和腹膜下重復使用AOM，約30周后出現自發(fā)性結腸癌。MNU的直腸內給藥導致結腸腫瘤發(fā)生率為100%，此外23%～31%的小鼠發(fā)生腸系膜淋巴結的轉移[17]。

致癌物誘導的結直腸癌模型在基因-環(huán)境相互作用和化學預防的研究中具有優(yōu)勢[18]，但是缺點是腫瘤發(fā)生率低，因此必須使用大量的實驗動物。此外，該模型不適合結直腸癌晚期和轉移形成機制研究，因為這種模型轉移進展非常緩慢且不常發(fā)生。

2.2 基因工程模型

通過研究家族性腺瘤性息肉?。‵AP）和遺傳性非息肉性結腸癌（HNPCC），揭示了結腸癌發(fā)生過程中存在基因突變[19]。具有某些基因突變的小鼠顯示出與人結腸癌和息肉相似的表型。從局部增生到腺瘤再到浸潤性癌最后發(fā)生轉移，這多階段的過程需要各種基因的連續(xù)突變。因此人們開始使用基因 工程小鼠來研究結直腸癌肝轉移。

結直腸癌的基因工程小鼠模型通常使用特定種系或遺傳修飾，這樣可用于研究遺傳性結直腸癌[6]。然而，散發(fā)性結直腸癌發(fā)生的是體細胞突變，占所有結腸直腸癌約80%，因此需要體細胞工程小鼠模型來研究結直腸癌的發(fā)生[20]。結直腸癌的大多數基因工程小鼠模型是根據雜合性喪失時誘導APC突變而產生的，盡管APC突變可導致侵襲性結直腸癌的形成，但尚未在這些模型中證實肝轉移[21]。最近，建立了一個相當高的肝轉移發(fā)展效率的結直腸癌基因工程小鼠模型。該模型是將Adeno-Cre注射到LSL-KRASG12V/APCflox/flox小鼠的結腸中產生，當結腸感染腺病毒誘導APC缺失和致癌KRASG12V激活，然后散發(fā)性結腸直腸癌的產生，隨后肝轉移[22]。

基因工程小鼠模型具有顯著的優(yōu)點，該模型提供有關癌發(fā)生過程中特定基因突變的影響，有效地評估腫瘤發(fā)生的早期步驟，有助于與結腸癌的發(fā)病機制相結合。與種植模型相比，基因工程模型更準確地代表了腫瘤進展的自然過程以及腫瘤細胞與微環(huán)境之間的相互作用[5]。此外，這些模型具有完整的免疫系統(tǒng)和特異性的微環(huán)境[23]。

但是它們缺點是通常不能完全重現人體腫瘤的遺傳復雜性。另外，從實驗角度出發(fā)，總體而言肝轉移很少發(fā)生，并且它們的發(fā)生是不可預測的[24]，即使發(fā)生肝轉移，也需要等待很長時間[25]，因此其潛在局限性在于難以評估治療反應[26]；在研 究某些特定基因的突變可導致胚胎致死，嚴重的發(fā)育缺陷或不育[27]；實驗的完成需要承擔昂貴經濟壓力且工作量大[28]。

2.3 PDX模型

皮下移植的PDX模型很少發(fā)生肝轉移，最常用的PDX肝轉移模型是患者來源的原位移植模型。研究[29-30]發(fā)現，從患者手術獲得的組織學上完整的結腸癌組織在10次傳代后，隨后原位植入裸鼠盲腸的PDX模型能發(fā)生肝轉移。其他研究也報道了原位PDX模型發(fā)生結直腸癌的肝轉移[31-33]。

來自細胞系的異種移植雖然具有重復好、易于操作和良好表型的優(yōu)點，但是它們沒有表現出原始 腫瘤的腫瘤異質性或組織病理學和遺傳特征[34-36]。相比之下，PDX模型更好地反映了原始腫瘤的特征和遺傳多樣性。因此，這些模型目前是用于測試藥物反應的最佳臨床前模型，特別是對于患有難治性癌癥的患者。此外，PDX模型可進一步用于個性化治療的基因組學和藥理學研究[31,35]。

PDX轉移模型的主要優(yōu)點是這些模型可以檢測患者對藥物的特異性治療反應并預測疾病過程，提供關于個性化治療的關鍵信息[5,37]。與來自癌細胞系的異種移植模型相比，PDX模型還在細胞和遺傳水平上保持原始腫瘤的異質性[34,31-32]。此外，PDX轉移模型提供了跟蹤轉移的起始和進展的機會[37]。

盡管具有這些優(yōu)點，但PDX轉移模型在轉移研究中具有許多缺點。已經表明，人腫瘤基質最初在移植后可以保存，但隨著時間的推移會逐漸被鼠基質取代[38]。盡管PDX是個性化醫(yī)療的希望，但PDX移植成功率并不高[39]，這可能會限制臨床效用。另外，腫瘤植入和篩選潛在療法可能需要6個月或更長時間。最后，臨床上通過PDX模型來進行診療價格十分昂貴，并且私人信息有時難以得到有效保護。

3 自發(fā)性肝轉移模型和實驗 性肝轉移模型：模擬轉移途徑的分歧

3.1 自發(fā)性肝轉移模型

自發(fā)性肝轉移模型是指將癌細胞系或組織植入結腸（原位移植）或皮下層（異位移植），導致在注射部位形成原發(fā)性腫瘤，隨后自行發(fā)生肝轉移。異位移植是腫瘤移植最簡單的方法。然而，這種模型大多不能發(fā)展肝臟轉移，因為皮下微環(huán)境與結腸完全不同 。相比之下，原位移植模型在組織學，血管分布，基因表達和轉移過程方面類似于人體癌癥。有學者[40]提出該模型應該滿足：首先，原發(fā)腫瘤必須定位在結腸；第二，原發(fā)性腫瘤必須來自結腸壁的黏膜層；第三，單個完整的腫瘤應植入黏膜層（以保持腫瘤細胞與基質細胞和細胞外基質的相互作用）；第四，應在肝、肺和淋巴結中檢測到轉移性病變。因此，自發(fā)性肝轉移模型主要選用原位移植模型。在該模型中，可以通過開放手術、灌腸、顯微注射和經肛門低劑量電凝等手段將結腸癌細胞系或人腫瘤組織移植到免疫受損小鼠的結腸壁中[41]。

為確保肝轉移的有效進展，體內選擇高轉移性腫瘤細胞是一項重要的策略。通過連續(xù)傳代可以增加移植腫瘤的轉移潛力。在這種方法中，致瘤樣本擴增后重新植入盲腸重復幾代，以獲得更高的致瘤性和轉移能力。這種具有高度轉移潛能的原位移植模型已被證明可有效進展為肝轉移。然而，這種選擇過程和隨后的體外細胞培養(yǎng)導致腫瘤細胞在二維環(huán)境中更適應生長而不是在正常的三維環(huán)境中。

原位自發(fā)性肝轉移模型的主要優(yōu)點是轉移遵循自然過程并利用類似于人體的機制。因此，該模型適用于預測人體腫瘤中的藥物反應。該模型代表著從原發(fā)部位形成到進展為肝轉移的整個轉移過程。它能夠研究轉移級聯中的所有步驟，可以模仿人體腫瘤微環(huán)境，并在腫瘤細胞中提供真實水平的異質性。此外，在自發(fā)轉移模型中分離的高轉移性腫瘤細胞所需的傳代次數少于實驗性轉移模型所需的傳代次數 。

該模型的缺點是從結腸到肝臟的自發(fā)轉移為低預測性和差重復性。由于異種移植物中缺乏功能性免疫系統(tǒng)，因此該模型難以評估免疫系統(tǒng)對轉移進展的作用。此外，發(fā)生肝轉移需要很長時間，有時需要切除原發(fā)腫瘤以減輕腫瘤負荷從而使轉移發(fā)生。此外，盲腸注射在技術上存在困難，并且存在腫瘤細胞滲漏或管腔內溢出的風險。

3.2 實驗性肝轉移模型

實驗性肝轉移模型是指實驗性地誘導肝轉移。實驗性轉移模型發(fā)生在不同器官中，取決于注射的部位和注射細胞的向性。在實驗性肝轉移模型中，是將結腸癌細胞直接注射到脾臟或門靜脈中。腫瘤細胞在不經歷原發(fā)性腫瘤生長和血管內滲出等步驟的情況下到達肝臟微循環(huán)，然后因大小或特定的因素而滯留。這些腫瘤細胞經歷細胞外滲并進入肝實質，或者它們可能直接在脈管系統(tǒng)內生長。部分注射細胞最終形成肝轉移瘤。為了提高肝轉移的效率，先前描述的在自發(fā)模型中連續(xù)傳代方法在實驗模型中是必要的。有報道稱，當人體結腸癌細胞注入免疫受損小鼠的脾臟時，高度惡性的細胞會發(fā)生肝臟轉移[3,7,9,42-43]。

實驗性轉移模型為轉移研究提供了許多優(yōu)勢。腫瘤細胞直接注入體循環(huán)，因此轉移發(fā)生需要的時間很短。此外，這些模型具有高度可重復性并且始終導致轉移形成。與自發(fā)轉移模型相比，這些模型中的轉移形成更有效。使用這些模型能夠控制引入循環(huán)中的腫瘤細胞的數量和類型，這對于實現實驗終點十分重要。此外，轉移器官可以靶向特定部位[3,42,44-45]。

實驗性轉移模型的主要缺點是這些模型不能代表整個轉移過程。 它們僅代表轉移級聯的晚期，因為它們繞過早期階段，包括原發(fā)性腫瘤生長和腫瘤細胞的內滲。應通過連續(xù)傳代分離腫瘤細胞，以增強其組織特異性能力。轉移遵循人工途徑，而不是其自然過程[3,9,42]。

4 理想的小鼠 結直腸癌癌肝轉移模型

適合對腫瘤轉移研究的理想動物模型應該具備一些條件和因素，例如：不管是原發(fā)性腫瘤還是轉移性腫瘤都應該可預測和重復，能夠得到廣泛應用；保持腫瘤的異質性和微環(huán)境；在動物體內能重建完整的腫瘤轉移過程；從模型的應用價值出發(fā)，應該可以用來做腫瘤患者的藥效學評價或者新治療手段的測試。但是目前很難同時滿足所有條件，應當根據具體實驗需要選擇恰當的模型。例如側重研究腫瘤微環(huán)境和免疫相關機制時，在免疫缺陷動物中移植異種細胞則不適合；側重研究腫瘤的轉移途徑時，則應該在結直腸原位形成腫瘤，讓其自發(fā)形成肝轉移，而不是在肝臟直接形成腫瘤。

5 小結與展望

各小鼠模型各自有優(yōu)缺點詳見表1。建立結直腸癌肝轉移的小鼠模型有助于對轉移過程和機制的了解。理想的肝轉移模型應該建立可預測和可重復的條件上。此外，未來原發(fā)性腫瘤模型應能同時擬合結直腸癌腫瘤（表觀）遺傳學、病理學、解剖學特性，其結直腸癌肝轉移模型具備短時間自發(fā)發(fā)生肝轉移的能力，以此來有效地代表人體腫瘤微環(huán)境，并可用于驗證多種治療癌癥患者。雖然目前應用于肝轉移的理想模型方面仍存在局限性，但幸運的是，基因組編輯技術的發(fā)展，如CRISPR/Cas系統(tǒng)，已經為肝轉移模型的發(fā)展提供了新的手段，關于腫瘤發(fā)生和轉移機制的表觀遺傳學研究也正是目前基礎醫(yī)學研究的熱點之一，這些進展未來必將會為結直腸癌肝轉移模型帶來革新?？傊祟悇游锬Ｐ偷哪繕耸峭ㄟ^對其潛在轉移機制研究為患有難治性結腸直腸癌的患者設計有效的治療方法。

表1 小鼠肝轉移模型的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of models of different mouse models of CRC liver metastasis