孫夢雨，邱潔萍，吳之涵，張倩，朱爽秋，陳博

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230000；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胃腸外科，安徽 合肥 230000）

胃癌是最常見的胃腸道腫瘤之一，是一種全球性的健康問題。近來，胃癌患者的治療在很大程度上取決于腫瘤病理分期，病理活檢仍然在胃癌的診斷中發(fā)揮著重要作用[1]。然而，活檢對于潛在胃癌患者沒有顯著作用，大多數(shù)具有特定不適癥狀的患者其實已發(fā)展至中晚期，因此全球胃癌患者的5年生存率僅為10%左右[2]。由于對胃癌進(jìn)行了廣泛篩查，在美國這一比率約為30.4%，而韓國的胃癌患者5年生存率超過65%[1]。

研究表明，大量生化標(biāo)志物參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程并可用于早期篩查[3]，但許多現(xiàn)有指標(biāo)過于敏感，在不同種類的腫瘤發(fā)生中均有差異表達(dá)。因此，有必要進(jìn)一步探究胃癌發(fā)生發(fā)展中新的、特異性高的診斷標(biāo)志物和治療靶點。目前，高通量測序已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要工具，在癌癥早期診斷、癌癥分級和預(yù)后預(yù)測等研究中的使用愈發(fā)廣泛[4]，各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫如GEO也為癌癥基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)挖掘提供了平臺[5]。本研究從GEO中下載原始數(shù)據(jù)，通過比較胃癌樣本與正常組織樣本的基因表達(dá)譜篩選出差異表達(dá)基因，對差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析并結(jié)合Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)后分析，進(jìn)而從分子水平研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為胃癌的診斷、靶向藥物研究及判斷預(yù)后提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)

從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/）中篩選出3套胃癌數(shù)據(jù)集（GSE13911、GSE33651、GSE79973），其中數(shù)據(jù)集GSE13911和GSE79973基于GPL570平臺（[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array），數(shù)據(jù)集GSE33651基于GPL2895平臺（GE Healthcare/Amersham Biosciences CodeLink Human Whole Genome Bioarray）。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

利用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的在線分析工具GEO2R（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/geo2r/）處理原始數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)分為胃癌組和正常組進(jìn)行進(jìn)一步分析。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：校正后P值＜0.05，|logFC|≥1。對每個數(shù)據(jù)集進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用在線工具Venn diagram（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）確定3組數(shù)據(jù)的相交部分。

1.3 差異表達(dá)基因的基因本體論（gene ontology，GO）分析和通路（KEGG）分析

GO分析是大規(guī)模功能富集研究的常用方法，基因功能被分成生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）3類。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是一個整合了大量關(guān)于基因組、疾病、化學(xué)物質(zhì)和藥物、生物途徑和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，可對基因功能進(jìn)行系統(tǒng)分析。本研究使用David（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG分析，P＜0.05且基因數(shù)（gene count）≥10，可認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和樞紐基因的篩選

利用STRING（http://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），互作評分＞0.4作為閾值條件。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape（www.cytoscape.org/）進(jìn)行可視化，計算節(jié)點的邊（degree），具有較高連接度的節(jié)點往往對維護(hù)整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定更加重要，本研究選取前10位為樞紐基因。

1.5 樞紐基因的預(yù)后分析

使用Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/）數(shù)據(jù)庫來評估樞紐基因的預(yù)后價值。對于每個基因，根據(jù)mRNA表達(dá)值自動將癌癥患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組進(jìn)行比較，每個基因所用的探針I(yè)D顯示在表3中，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

該研究選擇了3組基因表達(dá)譜（GSE13911、GSE33651、GSE79973）。其中，GSE13911含38個胃癌樣本和10個正常組織樣本，GSE33651含40個胃癌樣本和12個正常組織樣本，GSE79973含10個胃癌樣本和10個正常組織樣本。根據(jù)調(diào)整后P＜0.05和|logFC|≥1的標(biāo)準(zhǔn)，GSE13911中共鑒定出3 288個差異基因，包括1 001個上調(diào)基因和2 287個下調(diào)基因；GSE33651中共鑒定出2 178個差異基因，包括1 588個上調(diào)基因和590個下調(diào)基因；GSE79973共鑒定出1 405個差異基因，包括個486上調(diào)基因和919個下調(diào)基因。繪制韋恩圖分析以得到3組數(shù)據(jù)集差異基因的交集，共135個基因在3組中均有差異表達(dá)，其中68個基因明顯上調(diào)，67個明顯下調(diào)（圖1）。

圖1 差異表達(dá)基因Figure 1 Differentially expressed genes

2.2 差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

使用DAVID進(jìn)行差異基因的GO和KEGG分析。GO分析顯示差異基因主要富集的BP：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞外基質(zhì)組織，細(xì)胞黏附，氧化還原過程；主要富集的MF：鈣離子結(jié)合，相同蛋白結(jié)合；主要富集的CC：細(xì)胞外外泌體，細(xì)胞外空間，細(xì)胞外區(qū)域，細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞表面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。KEGG分析顯示差異基因主要富集的通路包括：PI3K/Akt信號通路，ECM受體相互作用，黏著斑（表1）。

表1 胃癌差異基因的GO和KEGG分析結(jié)果Table 1 Results of GO and KEGG analyses of the differentially expressed genes in gastric cancer

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和樞紐基因鑒定

利用STRING預(yù)測差異基因間的相互作用，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化，PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及個61節(jié)點和170條邊（圖2）。選取PPI網(wǎng)絡(luò)中連通度（degree）排序前10的為樞紐基因（表2）。結(jié)果表明，最具代表性的基因為COL1A1，連通度為21，其次分別為COL1A2、COL4A1、FN1、THBS1、CD44、COL2A1、COL4A2、CXCL8、COL5A1。

圖2 差異表達(dá)基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)（紅色：上調(diào)，綠色：下調(diào)）Figure 2 PPI network of the differentially expressed genes (Red: up-regulated; Green: down-regulated)

表2 樞紐基因名稱及連通度Table 2 Names and degrees of the hub genes

2.4 樞紐基因的預(yù)后分析

為研究10個樞紐基因的預(yù)后價值，本研究使用Kaplan-Meier plotter進(jìn)行預(yù)后分析，共有876例胃癌患者的數(shù)據(jù)可用于分析總體存活率。其中，除THBS1的上調(diào)（HR=0.84，95% CI=0.7～1.01，P=0.065）對胃癌患者總體存活率無明顯影響，其余基因的差異表達(dá)均影響胃癌患者的總體生存率，9個影響胃癌患者預(yù)后的樞紐基因的具體信息見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因的預(yù)后分析Figure 3 Prognostic analysis of differentially expressed genes

3 討 論

本研究從GSE13911、GSE33651、GSE79973數(shù)據(jù)集中共篩選出135個差異表達(dá)基因，包括68個上調(diào)基因和67個下調(diào)基因。此外，GO分析結(jié)果表明差異基因主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞外外泌體等生物學(xué)過程。KEGG分析顯示差異基因主要富集的通路包括：PI3K/Akt信號通路，ECM受體相互作用，黏著斑。本研究預(yù)測了胃癌相關(guān)的10個樞紐基因：COL1A1、COL1A2、COL4A1、FN1、THBS1、CD44、COL2A1、COL4A2、CXCL8、COL5A1。

PPI分析結(jié)果顯示，有6個樞紐基因?qū)儆谀z原蛋白（collagen，COL）家族，其中COL1A1、COL1A2、COL4A1是連通度排名前三的樞紐基因，這表明膠原蛋白基因與胃癌的侵襲和進(jìn)展關(guān)系最為密切，可能是胃癌的潛在靶點。胃癌發(fā)展通常是多步驟的漸進(jìn)過程，COL1A1在胃癌組織中顯著過表達(dá)，但從癌前病變到腫瘤階段其表達(dá)量無顯著變化[6]，這表明COL1A1可能在癌前病變的發(fā)生中發(fā)揮作用，COL1A1的高表達(dá)可能作為胃癌患者的早期診斷標(biāo)志物，Wang等[7]證實miR-129-5p可以通過選擇性降低COL1A1的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。研究[8-9]表明COL1A2 在結(jié)直腸癌和髓母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，Li等[6]認(rèn)為COL1A2 的表達(dá)與腫瘤大小和侵襲深度有關(guān)，其過表達(dá)提示不良預(yù)后，Ao等[10]證明COL1A2基因的沉默可抑制胃癌細(xì)胞的增殖侵襲，同時通過失活PI3k/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。COL4A1的突變是多效的，可導(dǎo)致多種腫瘤進(jìn)展，膀胱癌細(xì)胞中過表達(dá)的COL4A1通過誘導(dǎo)腫瘤出芽在腫瘤侵襲中起關(guān)鍵作用[11]，Jin等[12]研究發(fā)現(xiàn)COL4A1高表達(dá)有助于乳腺癌細(xì)胞的增殖。COL4A1可作為肝內(nèi)膽管癌預(yù)后的生物標(biāo)志物之一[13]，還可通過多種機(jī)制如細(xì)胞增殖和miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后修飾驅(qū)動胃癌細(xì)胞發(fā)生曲妥珠單抗耐藥[14]，這表明靶向COL4A1可能是癌癥治療的潛在方法。COL2A1、COL4A2、COL5A1分子并非特異表達(dá)于胃癌，在胃癌研究中相對較少，可作為潛在的靶點進(jìn)行進(jìn)一步探索。

一些研究表明，PI3k/Akt途徑的許多組分通過擴(kuò)增、突變和易位比癌癥發(fā)展中其他途徑更易被靶向而導(dǎo)致途徑激活[15]，纖連蛋白1（FN1）主要參與該途徑，在各種惡性腫瘤中表達(dá)。FN1參與細(xì)胞粘附和遷移過程，有研究[16]表明纖連蛋白的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲，與胃癌進(jìn)展顯著相關(guān)。

盡管THBS1在血管生成中的作用已得到充分證實，但其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用仍有待探索。一項研究[17]表明，THBS1的表達(dá)與乳頭狀甲狀腺癌的侵襲程度呈負(fù)相關(guān)，而其他研究報道THBS1是前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的有效刺激因子，這表明THBS1在癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用產(chǎn)生了混合的結(jié)果。有研究[18]表明，與鄰近的正常組織相比，THBS1在胃癌組織中顯著過表達(dá)，Huang等[19]認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中的THBS1有調(diào)節(jié)血管生成、粘附、增殖、侵襲、遷移和免疫的功能，THBS1的多效性取決于環(huán)境條件，其與不同受體結(jié)合可能對細(xì)胞行為和生物過程產(chǎn)生不同甚至相反的影響，THBS1對胃癌進(jìn)展的影響仍需要進(jìn)一步研究。

根據(jù)癌癥干細(xì)胞（CSC）理論，癌癥干細(xì)胞可以驅(qū)動腫瘤發(fā)生過程，包括癌癥的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和疾病復(fù)發(fā)[20]。CD44是一種CSC標(biāo)志物，通過STAT3-cyclin D1途徑調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞[21]，可在多種腫瘤包括肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、頭頸癌和下咽鱗狀細(xì)胞癌中起預(yù)后標(biāo)志物的作用[22]，Wang等[23]研究表明表達(dá)CD44的癌細(xì)胞易于偽裝從而逃脫人體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，使腫瘤更易轉(zhuǎn)移。

趨化因子（CXC）在腫瘤生物學(xué)中起到重要作用。雖然一些CXC趨化因子通過將免疫細(xì)胞吸引到腫瘤組織中或通過抑制腫瘤新血管形成而具有抗腫瘤活性，但其它趨化因子可通過直接刺激生長、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動或刺激血管生成來促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[24-26]。已知CXCL8在許多惡性腫瘤中是強(qiáng)血管生成因子，有研究證明人胃癌細(xì)胞表達(dá)的CXCL8蛋白與腫瘤血管的數(shù)量相關(guān)，表明CXCL8確是胃癌的血管生成因子[27]，可作為胃癌的分子靶標(biāo)進(jìn)行研究。

為驗證生物信息學(xué)分析的結(jié)果，本研究使用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫檢驗樞紐基因的預(yù)后價值。除THBS1外，所有樞紐基因均與胃癌患者的總體生存率顯著相關(guān)，此外，預(yù)后結(jié)果表現(xiàn)出與生物信息學(xué)分析基本相同的表達(dá)趨勢，從而驗證了本研究方法的準(zhǔn)確性。本研究可為將來胃癌的分子機(jī)制、生物標(biāo)志物及靶向藥物的研究提供思路，今后仍需分子生物學(xué)實驗進(jìn)一步探討差異基因在胃癌進(jìn)展中的具體作用機(jī)制。