劉靖芷，史可梅，王曉娟，李全波，王慧星，付強(qiáng)，秦麗媛

外周神經(jīng)系統(tǒng)脈沖射頻（pulsed radiofrequency，PR）通過神經(jīng)調(diào)控作用起到鎮(zhèn)痛效果，可用于治療頑固性疼痛［1-2］。研究顯示，脊髓星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化與痛覺過敏的產(chǎn)生和疼痛持續(xù)狀態(tài)有密切關(guān)系［3-4］。有研究表明，炎性痛大鼠可見脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化［4-5］。脈沖射頻對(duì)炎性痛及神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用已多見報(bào)道，但有關(guān)脈沖射頻對(duì)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響研究較少，脈沖射頻鎮(zhèn)痛機(jī)制尚未明確。本研究擬評(píng)價(jià)背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻術(shù)對(duì)炎性痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物補(bǔ)體受體-3 的單克隆抗體（clone name of monoclonal antibody of complement receptor type 3,OX42）和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)的影響，以期為闡明背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻術(shù)減輕炎性痛的機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量200～250 g，6～8周齡，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（C 組）、脈沖射頻組（PR 組）、炎性痛組（IP組）和炎性痛+脈沖射頻組（IP+PR組）4組（n=8）。

1.2 炎性痛模型制備 除C 組和PR 組外，IP 組和IP+PR 組大鼠參照文獻(xiàn)［6］方法制備炎性痛模型，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，俯臥位固定在固定器上，碘伏消毒右后足底，從右后足跖骨處緩慢注射2.5%福爾馬林（上海銳聰科技發(fā)展有限公司）100μL，拔針后用消毒棉按壓針孔，防止藥液流出。C組和PR組同法麻醉下注射等容量生理鹽水。

1.3 疼痛行為學(xué)測(cè)試 所有大鼠于造模前1 d 和造模后1、3、5和7 d于固定時(shí)間（14:00—17:00）在安靜環(huán)境下參照文獻(xiàn)［7］測(cè)定右后足機(jī)械縮足反應(yīng)閾（MWT），將大鼠置于金屬籠內(nèi)20 min 后，采用BSEVF3 電子von Frey 纖維絲（Harvard Apparatus公司，美國(guó)）于右后足2、3趾骨間垂直施加壓力，記錄出現(xiàn)快速縮足反應(yīng)、舔舐右足或嘶叫反應(yīng)時(shí)的壓力，測(cè)定3次，間隔1 min，取平均值作為MWT，為防止鼠爪損傷，最大壓力設(shè)置為50 g，超過此壓力無(wú)反應(yīng)則剔除。參照文獻(xiàn)［8］測(cè)定熱縮足潛伏期（TWL），將大鼠置于YSL-6B熱痛儀（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）的熱板上，記錄從右后足接觸熱板到出現(xiàn)縮足反應(yīng)、舔舐右足或嘶叫反應(yīng)的時(shí)間，測(cè)定5次，間隔20 min，取平均值即為TWL，TWL上限定為30 s以防止?fàn)C傷，超過此時(shí)間無(wú)反應(yīng)則剔除。

1.4 背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻 于造模后第4天（4 d）腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，俯臥位固定，背部剃毛備皮、碘伏消毒、75%乙醇脫碘后，觸摸大鼠髂嵴最高點(diǎn)，即L5棘突，于L5棘突左側(cè)切開皮膚，暴露約3 個(gè)棘突的距離，鈍性分離腰背部肌肉，暴露棘突和椎旁肌肉組織，鈍性剝離椎旁軟組織，暴露L4-5橫突及椎間孔，直視下沿神經(jīng)根走行方向?qū)⑸漕l電極穿刺針（22 G×50×4，英諾曼德醫(yī)療科技有限公司，德國(guó)）針尖置于L4-5椎間孔內(nèi)背根神經(jīng)節(jié)，R2000B北琪射頻治療儀（北京北琪醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行阻抗測(cè)試，阻抗為400～550 Ω，確認(rèn)射頻針尖端位于神經(jīng)組織，PR 組及IP+PR 組進(jìn)行脈沖射頻術(shù)（時(shí)間180 s、溫度42 ℃）；C組及IP組僅將射頻電極放置180 s。

1.5 Western blot 檢測(cè)GFAP和OX42蛋白表達(dá) 于最后1次痛閾測(cè)定結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取L4-6脊髓組織，置于-80 ℃冰箱保存。制備脊髓組織勻漿，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用濕式電轉(zhuǎn)移法（100 V，1 h），轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入GFAP 一抗（稀釋度1∶500，Abcam 公司，美國(guó)）、OX42 一抗（稀釋度1∶500，Abcam 公司，美國(guó)）及β-actin 一抗（稀釋度1∶1 000，Abcam 公司，美國(guó)），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶5 000，Abcam 公司，美國(guó)）孵育2 h 后，室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次，每次5 min；DAB 顯色，曝光、顯影、定影。采用Quantity One 圖像分析軟件測(cè)定條帶光密度值，以目的蛋白條帶光密度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的計(jì)量資料采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，各組內(nèi)多時(shí)點(diǎn)間比較用Bonferroni法，每個(gè)時(shí)點(diǎn)多組間比較使用多元方差分析法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MWT 和TWL 的比較 各組大鼠MWT 和TWL 時(shí)間效應(yīng)與干預(yù)措施間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且存在交互作用（P＜0.05），見表1、2。（1）與造模前比較：C組與PR組造模后各時(shí)點(diǎn)與造模前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IP組與IP+PR組造模后MWT和TWL均較造模前降低（P＜0.05），見表1、2。（2）組間比較：造模前各組間MWT 和TWL、造模后各時(shí)點(diǎn)C組與PR組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模后IP組與IP+PR組均較C組與PR組降低（P＜0.05），IP+PR組較IP 組于脈沖射頻術(shù)后即d5 和d7 時(shí)升高（P＜0.05），脈沖射頻術(shù)前即d1 和d3 時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、2。

2.2 各組大鼠OX42 和GFAP 表達(dá)水平的比較 與C組和PR組比較，IP組和IP+PR組GFAP和OX42相對(duì)表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.01）；與IP 組比較，IP+PR組GFAP和OX42表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），見圖1、表3。

3 討論

Fig.1 The Western blot results of GFAP and OX42 in four groups圖 1各組大鼠GFAP和OX42的Western blot表達(dá)

福爾馬林炎性痛模型廣泛用于炎性痛的實(shí)驗(yàn)研究，通常給予福爾馬林后約3 h大鼠出現(xiàn)舔足縮爪等明顯的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，可持續(xù)1～2周，因此本研究選用福爾馬林炎性痛模型。本研究結(jié)果顯示，IP 組和IP+PR 組造模后與造模前比較，各時(shí)點(diǎn)MWT 降低，TWL 縮短，表明大鼠炎性痛模型制備成功。本研究參照文獻(xiàn)［9］的方法行背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻術(shù)，與IP組比較，IP+PR組行脈沖射頻術(shù)后（d5和d7）出現(xiàn)MWT 升高、TWL 延長(zhǎng)，表明背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻術(shù)可減輕炎性痛大鼠的痛敏。

脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化可釋放大量與疼痛傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)的活性物質(zhì)，參與疼痛調(diào)節(jié)過程，與痛覺過敏的產(chǎn)生和持續(xù)狀態(tài)有密切關(guān)系［3-5,10］。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可釋放白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥介質(zhì)及神經(jīng)肽P 物質(zhì)（substance SP），分別激活感覺神經(jīng)元表面IL-1β和TNF-α受體及脊髓背角感覺神經(jīng)元表面神經(jīng)激肽-1 受體，可致神經(jīng)元興奮性升高，導(dǎo)致痛覺過敏，這些炎性介質(zhì)參與疼痛的產(chǎn)生和維持［11-14］。小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的補(bǔ)體受體-3的單克隆抗體為OX42，是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，疼痛產(chǎn)生時(shí)，OX42 表達(dá)水平增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞活化［3,11］。脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)，其特異性標(biāo)志物GFAP表達(dá)水平增加［13-14］，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體等，可改變突觸間隙谷氨酸濃度，在痛覺調(diào)節(jié)中起著重要作用［13-15］，因此，本研究檢測(cè)脊髓GFAP 和OX42 表達(dá)以分別反映星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化水平。本研究結(jié)果顯示，與C 組比較，IP組和IP+PR組炎性痛造模后大鼠脊髓OX42和GFAP表達(dá)升高，提示炎性痛大鼠存在脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化；與IP組比較，IP+PR組大鼠行脈沖射頻術(shù)后OX42和GFAP表達(dá)降低，表明背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻術(shù)可抑制炎性痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，結(jié)合疼痛行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，提示背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻術(shù)減輕大鼠炎性痛的作用可能與抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化相關(guān)。綜上，背根神經(jīng)節(jié)脈沖射頻可降低炎性痛大鼠痛敏及抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

Tab.1 Comparison of MWT between the four groups表1 各組大鼠MWT的比較 （n=8，g，±s）

Tab.1 Comparison of MWT between the four groups表1 各組大鼠MWT的比較 （n=8，g，±s）

F組間=4 352.340，F(xiàn)時(shí)間=1 320.630，F(xiàn)交互=552.675，均P＜0.05；A與d0比較，a與C組比較，b與PR組比較，c與IP組比較，P＜0.01；各組內(nèi)造模后多時(shí)點(diǎn)間不作比較；表2同

組別C組PR組IP組IP+PR組造模前（d0）24.77±0.35 25.03±0.43 24.92±0.52 24.86±0.49造模后d1 24.12±0.41 25.11±0.58 12.21±0.35Aab 11.97±0.57Aab d3 23.95±0.61 24.75±0.43 10.02±0.28Aab 9.87±0.43Aab d5 24.13±0.55 24.81±0.63 8.17±0.43Aab 15.77±0.88Aabc d7 24.37±0.46 25.32±0.71 6.77±0.27Aab 17.56±0.67Aabc

Tab.2 Comparison of TWL between the four groups表2 各組大鼠TWL比較 （n=8，s，±s）

Tab.2 Comparison of TWL between the four groups表2 各組大鼠TWL比較 （n=8，s，±s）

F組間=494.215，F(xiàn)時(shí)間=111.039，F(xiàn)交互=55.673，均P＜0.05；A與d0比較，a與C組比較，b與PR組比較，c與IP組比較，P＜0.01

組別C組PR組IP組IP+PR組造模前（d0）20.8±1.3 21.2±1.2 21.1±1.4 21.2±1.2造模后d7 21.3±1.4 21.1±1.2 6.9±0.9Aab 18.2±1.5Aabc d1 21.1±1.7 21.0±1.1 11.7±1.1Aab 11.4±1.2Aab d3 21.0±1.5 20.9±1.1 9.2±0.7Aab 9.3±0.9Aab d5 20.7±1.8 20.0±1.3 8.1±0.7Aab 15.7±1.3Aabc

Tab.3 Comparison of protein expressions of OX42 and GFAP between four groups of rats表3 各組大鼠OX42和GFAP表達(dá)水平的比較 （n=8，±s）

Tab.3 Comparison of protein expressions of OX42 and GFAP between four groups of rats表3 各組大鼠OX42和GFAP表達(dá)水平的比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與C組比較，b與PR組比較，c與IP組比較，P＜0.05

組別C組PR組IP組IP+PR組F GFAP 0.61±0.10 0.63±0.09 1.12±0.18ab 0.91±0.12abc 29.301＊OX42 0.35±0.04 0.36±0.03 0.71±0.06ab 0.49±0.05abc 104.527＊