李 穎，馬洪偉，付秀美，陳志宏，薛景鳳△

（1.承德醫(yī)學院，河北承德 067000； 2.北京市朝陽區(qū)高碑店社區(qū)衛(wèi)生服務中心）

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）發(fā)病率可高達30%～90%，是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見的慢性并發(fā)癥，且缺乏特效的西藥，是DM患者致殘甚至致死的主要原因。大量研究表明，DPN的發(fā)病機制與缺血缺氧、氧化應激、山梨醇通路紊亂等諸多因素相關[1-2]。周圍神經是DPN的研究焦點，但對與周圍神經相關的胞體的關注相對不足。胞體是神經元結構和功能的中心，研究DPN相關神經元胞體的病理變化對進一步探討DPN的發(fā)病機制具有重要意義。遠志為我國常用的中草藥，有益智強志之功效，對神經系統(tǒng)具有良好的保護作用[3-4]。本研究旨在通過觀察DPN大鼠背根節(jié)神經元凋亡的變化，探討遠志對DPN大鼠背根節(jié)神經元胞體損傷的預防保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年Wistar大鼠36只，雄性，體質量（200±20）g，河北醫(yī)科大學動物中心提供，合格證號：905075。遠志水煎液的制備：將中藥遠志浸泡、煎煮、過濾，濃縮成含生藥1g/ml的水煎液；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，美國Sigma公司）；小鼠抗Bcl-2、Bax單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；TUNEL檢測試劑盒（德國Roche公司）；SP免疫組織化學試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.2 動物分組與給藥 36只大鼠隨機分為3組：空白對照組，DPN模型組及遠志預防組，每組12只。DPN模型組及遠志預防組大鼠以2%的STZ按25mg/kg的劑量腹腔注射3d，以血糖≥16.7mmol/L為標準建立DM模型。DM模型建成后，遠志預防組大鼠給予遠志（生藥2.7g/kg/d）灌胃6周；DPN模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周，以尾部感覺神經傳導速度（sense nerve conduction velocity，SNCV）＜30m/s為DPN成模標準；空白對照組大鼠給予同等容積蒸餾水灌胃6周。用藥結束后，各組大鼠斷頭處死后迅速分離并取出與坐骨神經對應的背根節(jié)，一側背根節(jié)入液氮保存，另一側背根節(jié)入Bouins液固定。

1.3 SP免疫組織化學染色法檢測背根節(jié)Bcl-2、Bax陽性細胞數(shù) 取Bouins液固定的背根節(jié)，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚5μm。一抗按1：80稀釋，DAB顯色，以PBS替代一抗作為陰性對照。Bcl-2以背根節(jié)神經元胞漿顯現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應，Bax以背根節(jié)神經元胞漿及核膜顯現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。每個標本隨機選取3張切片在400倍顯微鏡下攝片，每張切片隨機選3個視野，分別計數(shù)每個視野Bcl-2、Bax陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.4 免疫印跡法檢測背根節(jié)Bcl-2、Bax蛋白的表達 取液氮中保存的背根節(jié)標本，提取蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，置于95℃熱水中變性10min，12% SDS-PAGE凝膠電泳，電壓80～120V（2h），70V穩(wěn)壓轉膜2h，5%脫脂奶粉封閉2h。加入一抗（β-actin 1：1000，Bcl-2 1：200，Bax 1：200）4℃孵育12h；二抗以1：5000稀釋，于室溫下置于搖床孵育1h，超敏發(fā)光液顯影后膠片感光成像。應用Gel-Pro Analyzer 4.0圖像分析軟件分析顯影條帶，分別將Bcl-2、Bax與β-actin條帶的積分光密度（IOD）值的比值作為Bcl-2、Bax蛋白的相對表達水平。

1.5 TUNEL法檢測背根節(jié)神經元凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI） 取Bouins液固定的背根節(jié)，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚5μm。采用TUNEL法檢測，DAB顯色，用熒光素標記的dUTP作為陰性對照，以背根節(jié)神經元胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性反應。每個標本取3張切片于400倍顯微鏡下攝片，每張切片隨機觀察3個視野，以視野內凋亡細胞數(shù)占視野內細胞總數(shù)的百分比作為AI，取平均值。

1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 背根節(jié)神經元Bcl-2、Bax的表達 與空白對照組大鼠比較，DPN模型組大鼠背根節(jié)神經元Bcl-2陽性細胞數(shù)明顯減少、Bcl-2的表達明顯降低（P＜0.01）；與DPN模型組大鼠比較，遠志預防組大鼠背根節(jié)神經元Bcl-2陽性細胞數(shù)明顯增多、Bcl-2的表達明顯升高（P＜0.01）（附表）。與空白對照組大鼠比較，DPN模型組大鼠背根節(jié)神經元Bax陽性細胞數(shù)明顯增多、Bax的表達明顯升高（P＜0.01）；與DPN模型組大鼠比較，遠志預防組大鼠背根節(jié)神經元Bax陽性細胞數(shù)明顯減少、Bax的表達明顯降低（P＜0.01）。見附表：

附表 各組大鼠背根節(jié)神經元Bcl-2、Bax的表達及AI值（±s ，n=12）

附表 各組大鼠背根節(jié)神經元Bcl-2、Bax的表達及AI值（±s ，n=12）

與空白對照組比較：*P＜0.01；與DPN模型組比較：△P＜0.01

組別 Bcl-2 Bax AI值陽性細胞數(shù) Bcl-2表達 陽性細胞數(shù) Bax表達空白對照組 44.33±2.40 1.13±0.05 10.14±2.48 0.66±0.03 7.47±1.49 DPN模型組 13.56±3.54* 0.49±0.02* 30.80±5.65* 1.21±0.03* 45.25±3.67*遠志預防組 33.00±2.87△ 0.97±0.02△ 11.67±2.87△ 0.81±0.02△ 11.95±1.44△images/BZ_10_1211_2802_1234_2835.png

2.2 背根節(jié)神經元的AI值 DPN模型組大鼠背根節(jié)神經元的AI值明顯高于空白對照組（P＜0.01），遠志預防組大鼠背根節(jié)神經元的AI值明顯低于DPN模型組（P＜0.01）。見附表。

3 討論

WHO的一項研究表明，到2030年DM患者將達到3.53億，而我國已成為DM患者最多的國家之一。DPN是DM最常見的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率隨病程延長逐年升高，嚴重影響患者的生活質量，且很大程度上增加了患者和社會的經濟負擔，因此，對DPN的預防和治療具有重要意義[5]。

目前，多數(shù)關于DPN的研究均將周圍神經纖維作為焦點，對胞體的關注相對不足。作為神經元結構和功能的中心，胞體維持著神經元的正常生理功能及神經纖維旺盛的再生能力。以往研究表明，周圍神經損傷可逆行性導致胞體受損乃至死亡[6]。細胞凋亡是受基因精準調控的細胞自主程序化死亡，Bcl-2蛋白家族為重要的凋亡調控因子之一。根據(jù)對細胞凋亡的影響可將Bcl-2家族分為兩類，一類是抗凋亡Bcl-2家組成員，如Bcl-2、Bcl-xL等；一類是促凋亡Bcl-2家族成員，如Bax、Bad等。Bcl-2位于線粒體內膜和細胞質中，具有維持線粒體電位、抗凋亡的作用。Bax可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產生阻抑作用。

本研究發(fā)現(xiàn)DPN模型組大鼠背根節(jié)神經元胞體抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax的表達明顯增多，且AI值明顯升高，表明DM時因為坐骨神經相關神經元發(fā)生凋亡導致了周圍神經損傷。

目前，對于DPN的防治尚缺乏有效措施，中藥因能多靶點、多環(huán)節(jié)治療疾病，且長期使用副作用小而備受研究者們的關注。遠志，又名繞、等，是我國常用的中草藥。遠志中的主要化學成分包括三萜皂苷類、糖酯類等，具有益智、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠等生物活性[7]。已有研究表明，遠志可通過抗氧化、穩(wěn)定線粒體膜電位等機制保護神經元。本課題組以往研究表明，遠志可延緩DPN大鼠尾部SNCV下降，降低坐骨神經中醛糖還原酶的活性、使坐骨神經微絲蛋白的表達升高，對DPN大鼠坐骨神經損傷具有良好的預防和保護作用[8]。本研究結果進一步表明，遠志預防組大鼠背根節(jié)神經元抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著增多、促凋亡蛋白Bax的表達顯著降低，且遠志預防組大鼠背根節(jié)的AI值明顯降低，提示遠志還可通過調控凋亡相關蛋白的表達抑制細胞凋亡，延緩DPN大鼠背根節(jié)神經元胞體損傷。

綜上所述，DPN大鼠坐骨神經相關神經元胞體Bcl-2表達減少和Bax的過度表達可能是DPN的發(fā)病機制之一。遠志可通過調控Bcl-2和Bax的表達抑制背根節(jié)神經元凋亡，保護DM時大鼠坐骨神經相關神經元胞體，延緩周圍神經損傷。