宋春紅，馬倩，甄娟，許紅，劉洋，畢學(xué)杰△

胎膜在臨產(chǎn)前自發(fā)性破裂稱為胎膜早破（premature rupture of the fetal membranes, PROM）。胎膜早破導(dǎo)致早產(chǎn)發(fā)生率升高，宮內(nèi)及產(chǎn)褥感染率皆增加，嚴(yán)重危害母嬰安全。導(dǎo)致胎膜早破發(fā)生的原因眾多，包括感染因素、社會(huì)因素及遺傳因素等。宮內(nèi)感染及由此導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在胎膜早破發(fā)生中發(fā)揮了重要作用［1］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體2 （nucleotide - binding oligomerization domaincontaining 2，NOD2）是固有免疫的胞質(zhì)受體，能識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌的肽聚糖，介導(dǎo)病原體所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。目前對(duì)NOD2及其下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胎膜早破發(fā)病中作用的研究較少。本研究檢測(cè)了NOD2、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、活化型Caspase-3在胎膜早破胎膜組織中的表達(dá)及羊水中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，探討各分子表達(dá)的相關(guān)性，為胎膜早破的預(yù)防和治療探索新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2016年12月在石家莊市第四醫(yī)院住院的產(chǎn)婦90 例。其中足月胎膜早破組（tPROM組，妊娠滿37 足周）30 例，平均年齡（29.3±2.7）歲；未足月胎膜早破組（pPROM 組，妊娠不滿37 足周）30 例，平均年齡（26.2±4.0）歲；正常妊娠晚期婦女（對(duì)照組）30 例，平均年齡（28.7±3.5）歲。各組均以剖宮產(chǎn)結(jié)束妊娠，無(wú)妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓綜合征等產(chǎn)科并發(fā)癥，且均為單胎初產(chǎn)，在臨產(chǎn)前未接受抗生素治療。胎膜早破的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考全國(guó)高等學(xué)校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版。該試驗(yàn)經(jīng)石家莊市第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得孕產(chǎn)婦本人同意后取得標(biāo)本。

1.2 標(biāo)本采集 羊水采集：在行剖宮產(chǎn)術(shù)時(shí)切開子宮肌層、胎膜充分暴露后，取羊水5 mL，所取羊水均于室溫下2 500 r/min離心5 min，取上清液，-70 ℃冰箱保存集中待測(cè)。胎膜采集：胎盤娩出后，立即取胎膜破口處全層胎膜組織5～10 g，以無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈，一部分組織吸干水分后置于凍存管中，-70 ℃保存、備用；另一部分于中性甲醛溶液固定后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片。

1.3 主要試劑 兔抗人MMP-9單克隆一抗購(gòu)自上海基因科技有限公司，小鼠抗人NOD2單克隆一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人活化型Caspase-3 單克隆一抗、兔抗人β-actin單克隆一抗、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，山羊抗兔/小鼠二抗購(gòu)自上?；蚩萍加邢薰?。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胎膜組織中NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3 的表達(dá) 免疫組化染色采用SP 法。胎膜組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波加熱修復(fù)抗原；3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；采用山羊血清于室溫封閉；一抗4 ℃冰箱過(guò)夜，采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。隔日PBS 洗滌，滴加抗體增強(qiáng)劑，37 ℃孵育20 min；沖洗后二抗37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌后，采用DAB 染色，于顯微鏡下控制染色強(qiáng)度；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)；常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片、鏡檢。檢測(cè)NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3在胎膜組織中的表達(dá)。以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色為陽(yáng)性，在顯微鏡下不著色或個(gè)別細(xì)胞淺著色等判讀為陰性。

1.5 Western blot 檢測(cè) 胎膜組織NOD2、MMP-9 及活化型Caspase-3 的表達(dá)水平 剪碎胎膜組織，加入細(xì)胞裂解液RIPA提取蛋白。檢測(cè)蛋白濃度后，每孔上樣60μg。行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，PBS 洗膜后，一抗4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光劑避光反應(yīng)，將硝酸纖維素膜放至暗室中曝光顯影。以β-actin 為內(nèi)參照，目的蛋白與其相比進(jìn)行半定量分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)羊水TNF-α 水平 采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定羊水中TNF-α水平，操作方法嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 法，采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 在胎膜組織中的定位 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 主要表達(dá)于胎膜組織羊膜上皮細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)，弱表達(dá)于蛻膜細(xì)胞胞質(zhì)，MMP-9 還表達(dá)于中性粒細(xì)胞胞質(zhì)，見圖1。

2.2 各組胎膜組織中NOD2、MMP-9 及活化型Caspase-3 的表達(dá)水平 Western blot 結(jié)果顯示，tPROM 組、pPROM 組NOD2、MMP-9 及 活 化 型Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），pPROM 組NOD2 表達(dá)高于tPROM 組（P＜0.05），tPROM 組與pPROM 組MMP-9、活化型Caspase-3 表達(dá)水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2。

Fig.1 Expressions of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 in fetal membranes(IHC,×100)圖1 NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3在胎膜組織中的表達(dá)（IHC，×100）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 proteins between three groups表1 各組相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=30，±s）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 proteins between three groups表1 各組相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與tPROM組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組tPROM組pPROM組F NOD2/β-actin 0.22±0.08 0.46±0.10a 0.52±0.08ab 95.563＊＊MMP-9/β-actin 0.98±0.21 1.28±0.15a 1.29±0.20a 27.660＊＊活化型Caspase-3/β-actin 0.27±0.08 0.68±0.10a 0.71±0.11a 191.230＊＊

Fig.2 Expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 in fetal membranes of three groups圖2 胎膜組織中的NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3蛋白表達(dá)

2.3 各組羊水中TNF-α 水平 tPROM 組、pPROM組羊水TNF-α 水平分別為（34.48±13.32）ng/L 及（56.40±11.66）ng/L，較對(duì)照組（8.89±3.37）ng/L 明顯升高（F=156.712，P＜0.01），pPROM 組水平高于tPROM組（P＜0.05）。

2.4 相關(guān)性分析 針對(duì)胎膜早破組的Pearson 相關(guān)分析顯示，胎膜組織NOD2 表達(dá)水平與羊水TNF-α水平呈正相關(guān)（r=0.373，P＜0.01），與胎膜組織中MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.412，P＜0.01），與胎膜組織中活化型Caspase-3 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.448，P＜0.01）。

3 討論

本研究顯示，在胎膜早破患者，胎膜組織NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 表達(dá)及羊水TNFα水平升高，胎膜組織NOD2表達(dá)水平與羊水TNF-α水平呈正相關(guān)，與胎膜組織中MMP-9、活化型Caspase-3的表達(dá)呈正相關(guān)，表明NOD2及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子激活/表達(dá)增加，在胎膜早破的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

3.1 MMP-9 與胎膜早破 完整的胎膜可以阻擋病原微生物上行感染，從而維持羊膜腔的無(wú)菌環(huán)境。任何影響胎膜的完整性、彈性和張力強(qiáng)度的因素都可以導(dǎo)致胎膜早破［2］。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，是鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，激活后主要形成Ⅳ型膠原酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)的明膠和Ⅳ、Ⅴ型膠原，在分娩發(fā)動(dòng)及胎膜早破過(guò)程中發(fā)揮作用。宮頸陰道液體中MMP-9水平在妊娠前期處于較低水平，在妊娠37周后明顯升高。在胎膜早破患者，血漿鋅水平升高，羊水和血漿中MMP-9 水平增加，而血清及胎膜中Ⅳ膠原含量下降，表明血漿鋅濃度增加導(dǎo)致MMP-9水平升高，從而降解胎膜組織中的Ⅳ膠原［3］。本研究直接檢測(cè)了胎膜組織中MMP-9表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在胎膜早破組明顯高于正常對(duì)照組。MMP-9水解胎膜組織的細(xì)胞外基質(zhì)后，導(dǎo)致胎膜組織的脆性增加，尤其是在宮頸附近胎膜組織形成薄弱區(qū)，促進(jìn)了胎膜早破的發(fā)生。

3.2 細(xì)胞凋亡與胎膜早破 細(xì)胞凋亡是一種基因控制的細(xì)胞自主性死亡過(guò)程，參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展。胎膜早破與細(xì)胞凋亡之間存在密切關(guān)系。胎膜早破患者胎膜組織中DNA 片段、Fas 及Caspase-8 表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax 及P53 表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達(dá)減少［4］。Caspase-3位于凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最末端，是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者和特異性分子標(biāo)記之一。本研究發(fā)現(xiàn)，胎膜早破患者活化型Caspase-3表達(dá)增加，胎膜細(xì)胞死亡增多，脆性增加，從而導(dǎo)致胎膜早破。其發(fā)生原因?yàn)閷m內(nèi)感染發(fā)生時(shí)，促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，細(xì)胞因子如TNF-α 促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白（TNFR-associated death domain protein,TFADD）表達(dá)，從而激活caspase基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。另外宮內(nèi)感染發(fā)生時(shí)MMP 增加導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解后，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和功能的支持作用喪失，胎膜細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.3 TNF-α 與胎膜早破 TNF-α 是一種生物學(xué)功能廣泛的多肽細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)炎性反應(yīng)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是重要的炎性介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子。在胎盤及其附屬物中，蛻膜細(xì)胞、絨毛膜細(xì)胞、羊膜細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞等也能產(chǎn)生一部分TNF-α。本研究表明，在胎膜早破患者羊水中TNF-α 水平升高，結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，TNF-α 導(dǎo)致胎膜早破的機(jī)制如下：（1）與腫瘤壞死因子受體1 結(jié)合后，通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 及絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）途徑誘導(dǎo)MMP-9 表達(dá)［6］，促進(jìn)胎膜細(xì)胞外基質(zhì)降解。（2）如上所述，TNF-α 與受體結(jié)合，募集TFADD，激活Caspase-8，最終激活Caspase-3 而發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用［5］。（3）MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)裂解膜結(jié)合細(xì)胞因子如TNF-α進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而凋亡又可誘導(dǎo)MMP-9激活，由此形成正循環(huán)促進(jìn)胎膜早破的發(fā)生。（4）在體外培養(yǎng)羊膜細(xì)胞中，TNF-α促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低羊膜破裂所需時(shí)間及機(jī)械壓力，促進(jìn)胎膜破裂［7］。

3.4 NOD2 與TNF-α、MMP-9、Caspase-3 及胎膜早破 NOD2 屬于胞漿內(nèi)NOD 樣受體家族，作為胞內(nèi)的模式識(shí)別受體，可以識(shí)別革蘭陰性菌及陽(yáng)性菌的胞壁酰二肽，可以抵御多種細(xì)菌，在宿主防御病原體中起到重要作用。NOD 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以激活NF-κB及MAPK 途徑［8］，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)及細(xì)胞功能活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。研究顯示NOD2存在于妊娠相關(guān)組織，并發(fā)揮病理生理作用，妊娠早期蛻膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)NOD2，在配體胞壁酰二肽刺激下NOD2表達(dá)水平升高，蛻膜間質(zhì)細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-1β 等促炎細(xì)胞因子，且蛻膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加［9］。胎膜早破患者胎兒體內(nèi)NOD2 基因存在突變，表明參與固有免疫的基因突變?cè)谔ツぴ缙频陌l(fā)生中發(fā)揮了重要作用［10］。在體外培養(yǎng)胎膜組織中，NOD2 在配體胞壁酰二肽刺激下可以促進(jìn)胎膜組織TNF-α 及MMP-9 分泌［11］。本研究顯示NOD2 在胎膜早破患者胎膜組織中表達(dá)升高，且與TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表達(dá)呈正相關(guān)，表明NOD2在胎膜早破發(fā)動(dòng)過(guò)程中起到重要作用，與TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表達(dá)相關(guān)，TNF-α又可以促進(jìn)NOD2表達(dá)，并誘導(dǎo)MMP-9 產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡，從而形成正反饋，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解和胎膜細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胎膜早破的發(fā)生。

綜上，胎膜早破患者胎膜組織中NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 表達(dá)水平升高，羊水中TNF-α水平增加，四者表達(dá)存在關(guān)聯(lián)作用，提示在胎膜早破發(fā)生發(fā)展中，NOD2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子升高、胎膜細(xì)胞外基質(zhì)降解及胎膜細(xì)胞凋亡，從而為胎膜早破的病因?qū)W研究提供了新的視角。