石 晴，朱德銳

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心 西寧 810016)

四氫嘧啶[Ectoine：(4S)-2-methyl-1，4，5，6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid]是一類嗜鹽或耐鹽菌胞內(nèi)合成的主要相容溶質(zhì)，是用于抵抗高鹽環(huán)境的一種重要物質(zhì)[1]。其結(jié)構(gòu)屬氨基酸環(huán)化衍生物或部分氫化嘧啶衍生物[2]，具有分子手性，化學(xué)方法難以合成[3]。在生化特性方面，Ectoine具有惰性、胞內(nèi)高耐受性、熱穩(wěn)定性和水溶性等特點(diǎn)[2]，影響細(xì)胞在逆境環(huán)境中的滲透壓調(diào)節(jié)功能，可提高細(xì)胞在高鹽、干旱和低溫等惡劣環(huán)境中的適應(yīng)性。Ectoine作為微生物重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-7]。

近年來，Ectoine的生物合成途徑從基因水平、酶水平和調(diào)控水平等方面已有較為深入的研究。用ectA、ectB和ectC3個(gè)基因分別編碼的L-2，4-二氨基丁酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Ect A)、L-2，4-二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(Ect B)和Ectoine合成酶(Ect C)調(diào)控Ectoine的生物合成[8]：首先，以L-天冬氨酸-β半醛(ASA)為底物在Ect B催化作用下生成L-2，4-二氨基丁酸(DABA)；其次，Ect A將DABA乙?；蒒-乙酰-L-2，4-二氨基丁酸(ADABA)；最后，將ADABA催化生成四氫嘧啶?；诖耍寺〖爱愒幢磉_(dá)Ectoine合成基因簇及其上游調(diào)控序列，用于闡明在鹽激條件下何種調(diào)節(jié)蛋白或因子參與Ectoine合成基因簇ectABC操縱子的啟動(dòng)應(yīng)答的分子機(jī)制。本研究以Halomonassp.QHL1為模式菌株，克隆ectABC基因簇及其上游調(diào)控序列，并對其在E.coilBL21中的蛋白表達(dá)及耐鹽能力進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Halomonassp.QHL1菌株分離自青海湖水體；菌株E.coilDH5α和E.coilBL21(DE3)由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心提供；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱)和GeneGreen核酸染料購自北京天根生化科技有限公司；克隆載體pMD18-T、表達(dá)載體pColdⅠDNA、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司；DL 5000 Maker購自廣東東盛生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。引物合成及DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

OSM液體培養(yǎng)基(g/L)：超純水內(nèi)加MgSO4·7H2O 20 g、KCl 2 g、Na3C6H5O7·2H2O 3 g、無水CaCl20.2 g、Yeast Extract 2 g、Tryptone 10 g、C6H12O65 g、NaCl 29.25 g，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.5，滅菌(120℃)20 min。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：超純水內(nèi)加Tryptone 10 g、Yeast Extract 5 g、NaCl 10 g，定容至1 L，滅菌(120℃)20 min。

LA固體培養(yǎng)基：每升LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g，滅菌(120℃)20 min，待培養(yǎng)基冷卻后，按照100 mL培養(yǎng)基加100 μL氨芐青霉素(終濃度為50mg/mL)的原則配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Halomonassp.QHL1基因組DNA的提取

將Halomonassp.QHL1菌株接種于OSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃，180r/min，過夜)。DNA提取參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 QHL1ectABC基因簇及其上游啟動(dòng)子序列的克隆

本課題組[9]前期已對Halomonassp.QHL1全基因組序列做生物信息學(xué)分析，獲得ectABC及其上游調(diào)控序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出特異性引物(表1)。以Halomonassp.QHL1全基因組DNA為模板，將F1/R1、F2/R2和F3/R3交叉配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50μL)：DNA模板2.5 μL；引物各1 μL；dNTP 4 μL；LA Taq酶1 μL；10×buffer(含Mg2+)5 μL；滅菌雙蒸水35.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃下延伸10 min。行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體TA互補(bǔ)連接后轉(zhuǎn)化至E.coilDH5α，篩選陽性質(zhì)粒做酶切驗(yàn)證并測序。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

將陽性質(zhì)粒pMD18-T-promoter+ectABC和表達(dá)載體pColdⅠDNA雙酶切(37℃)4 h后，純化回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4 DNA連接酶連接(過夜，16℃)，轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)。根據(jù)重組表達(dá)載體pColdⅠDNA-promoter+ectABC的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證，使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/PstⅠ做雙酶切、BamHⅠ做單酶切，挑取陽性重組子測序。

1.2.4 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

將重組菌株E.coilBL21/pColdⅠDNA-promoter+ectABC以IPTG時(shí)間梯度方法誘導(dǎo)：用LB培養(yǎng)基(50μg/mL Amp)誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌株48 h(15℃，180r/min，0.1 mmol/L IPTG)，間隔12 h取樣。離心收集誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體沉淀，加入1×PBS將菌體沖懸，在冰上超聲裂解至液體清亮。離心(12000r/min)5 min，收集上清液，用SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，以未誘導(dǎo)的E.coilBL21和pColdⅠDNA空載作陰性對照。

1.2.5 重組菌株的鹽耐受實(shí)驗(yàn)

將E.coilBL21菌株、E.coilBL21/pColdⅠDNA空載以及E.coilBL21/pColdⅠDNA-promoter+ectABC重組菌株使用LB液體培養(yǎng)基活化(37℃，培養(yǎng)至光密度值OD600約為0.6～0.8)，分別接種至不同NaCl濃度的LB培養(yǎng)基中，同一梯度設(shè)3個(gè)平行組，培養(yǎng)(37℃)12 h后采用紫外分光光度計(jì)測定OD600值，求均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

表1本實(shí)驗(yàn)中的引物序列

Table 1Primer sequences used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 ectABC基因簇及其上游啟動(dòng)子序列的克隆

以QHL1的基因組DNA為模板，用F1和R3這一對引物特異性擴(kuò)增得到四氫嘧啶合成基因簇ectABC及其上游啟動(dòng)子序列，經(jīng)電泳分析可知，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)，約為3 335 bp。純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD18-T-promoter+ectABC，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α構(gòu)建陽性質(zhì)粒。經(jīng)酶切(圖2)及測序驗(yàn)證，顯示陽性質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1Halomonassp.QHL1的ectABC及其上游啟動(dòng)子基因序列瓊脂糖電泳分析圖

Figure1The analysis ofectABCand its upstream regulation sequence fromHalomonassp.QHL1by agarose gel electrophoresis

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-promoter+ectABC的酶切鑒定圖

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將陽性質(zhì)粒pMD18-T-promoter+ectABC和表達(dá)載體pCold Ⅰ DNA的酶切產(chǎn)物連接，獲得重組表達(dá)載體pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC，轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)。重組質(zhì)粒pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC經(jīng)BamH Ⅰ和PstⅠ雙酶切后，目的片段約3 335 bp，與預(yù)期大小一致(圖3)。經(jīng)測序驗(yàn)證，顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3重組質(zhì)粒pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC的酶切鑒定圖

Figure3Identification of enzyme digestion of recombinant plasmid pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC

2.3 QHL1 ectABC基因簇及其上游啟動(dòng)子序列的異源表達(dá)

將重組表達(dá)菌株E.coilBL21/pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，對比發(fā)現(xiàn)IPTG濃度為0.1 mM、誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)，目的蛋白異源表達(dá)效果最佳。SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖4)：ectA、ectB和ectC分子量大小分別為：21.2、46.4、14.7 kDa，與預(yù)測結(jié)果一致，表明promoter+ectABC基因簇在E.coliBL21中能實(shí)現(xiàn)異源共表達(dá)。

M為蛋白Marker；1和2分別為未誘導(dǎo)的E.coilBL21和E.coilBL21/pCold Ⅰ DNA空載體；3到5分別為誘導(dǎo)12、24和48 h的重組菌株E.coilBL21/pColdⅠDNA-promoter+ectABC(0.1mM IPTG)

圖4SDS-PAGE分析promoter+ectABC基因簇在E.coilBL21中的異源表達(dá)

Figure4Heterologous expression of thepromoter+ectABCgene cluster in theE.coilBL21by SDS-PAGE analysis

2.4 重組菌株E.coil BL21/pColdⅠDNA-promoter+ectABC的耐鹽能力檢測

配制不同鹽濃度梯度(0～1.3mol/L NaCl)的LB培養(yǎng)基，檢測自帶啟動(dòng)子序列的ectABC基因簇的耐鹽能力。結(jié)果如圖5顯示：E.coilBL21耐鹽濃度為0.8 mol/L；而E.coilBL21/pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC耐鹽濃度達(dá)到1.3 mol/L，且生長量明顯高于對照菌株。與原始菌株相比，重組菌株耐鹽性明顯提高，能夠抵抗一定水平的滲透壓沖擊。

圖5重組菌株與對照菌株鹽耐受實(shí)驗(yàn)圖

Figure5Salt tolerance of the nativeE.coilandE.coilengineered

3 討論

鹽度是影響微觀和宏觀微生物群落組成的主要環(huán)境因素之一[10]。隨著鹽度的增加，多細(xì)胞生物的物種豐富度下降，在最高鹽度時(shí)，動(dòng)、植物消失，僅剩下古菌和細(xì)菌、真菌及原生生物等微生物[11]。研究發(fā)現(xiàn)，相容性溶質(zhì)在應(yīng)對高滲透壓方面起著重要作用[12]，這些相容性溶質(zhì)主要包括糖(如蔗糖和海藻糖)、多元醇(如甘油、山梨糖醇、甘露醇、α-葡萄糖基甘油、甘露糖基甘油和甘露糖基甘油酰胺)、甜菜堿(如甘氨酸甜菜堿和衍生物)和氨基酸及其衍生物(如脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶)等[13]。Ectoine是一種水結(jié)合兩性離子氨基酸衍生物，最早由Galinski等人在ctothiorhodospirahalochloris中發(fā)現(xiàn)[14]。Ectoine在各類中度嗜鹽菌的細(xì)胞中廣泛積聚，是嗜鹽微生物在高鹽脅迫下維持滲透壓平衡的一類主要相容性溶質(zhì)[15]。當(dāng)高滲沖擊時(shí)，微生物在胞內(nèi)大量積聚Ectoine以平衡高滲透壓；當(dāng)滲透壓降低時(shí)，微生物則向胞外釋放Ectoine[16-17]。此外，Ectoine對細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等還能起到抗冷凍、干旱、高溫、高鹽、輻射等作用[18]。

目前，已報(bào)道參與Ectoine生物合成的基因類型有ectABC、ectABCD、ectABC-ask和ectABCD-ask[19-20]，其生物合成相關(guān)基因已從多種微生物中克隆獲得，如唐娜等[21]通過SEFA-PCR步移方法從鹽單胞菌屬H.sociaNY-011T中克隆獲得ectABC和ectD基因，實(shí)現(xiàn)了E.coil異源表達(dá)；張慧艷等[22]從易變鏈霉菌TRM 45540中克隆了ectABC基因并實(shí)現(xiàn)了E.coil異源表達(dá)，且攜帶ectABC基因工程菌的耐鹽能力顯著提高；高波等[23]從密旋鏈霉菌Act12中克隆了基因簇ectABC并在E.coil中成功異源表達(dá)，但重組工程菌株的鹽耐受能力無明顯改善。大腸桿菌因其遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)熟練，與外源基因具有良好相容性的系統(tǒng)等特點(diǎn)[24]，被作為廣泛使用的工業(yè)菌株，用于構(gòu)建產(chǎn)生外蛋白的宿主生物。本研究中，模式菌株QHL1分類地位為鹽單胞菌屬，通過BLST比對分析發(fā)現(xiàn)Ectoine生物合成基因類型為ectABC。以QHL1基因組序列為模板，設(shè)計(jì)ectABC及其上游啟動(dòng)子序列的引物，克隆獲得Halomonassp.QHL1四氫嘧啶生物合成操縱子序列(3335bp)并在E.coilBL21中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，且重組菌株(E.coilBL21/pCold Ⅰ DNA-promoter+ectABC)的鹽耐受能力明顯提高。