寇 娜，周義玲，紀(jì)巧榮，張 昱，劉 杰，高 翔，袁周陽(yáng)，張 偉

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810001)

國(guó)際上將海拔2 500米以上的地區(qū)定義為高原[1]。高原環(huán)境作為一個(gè)特殊的生態(tài)系統(tǒng)，具有低壓、低氧特點(diǎn)。其是否會(huì)對(duì)機(jī)體的消化系統(tǒng)及免疫功能產(chǎn)生影響，本研究通過(guò)觀測(cè)低氧7、14 d小鼠體重，血常規(guī)和結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的變化，以及腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子、血清中免疫球蛋白含量的變化，探討短期低壓低氧對(duì)小鼠腸道免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雌性6周齡小鼠，體重(26±2)g。購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，NO：11400700176022]。

以無(wú)菌水和消毒食物飼養(yǎng)(IVC)4周后，每組選用10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物的使用和處理經(jīng)過(guò)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

抗小鼠CD3抗體(Anti-CD3)、抗小鼠1stAb、標(biāo)準(zhǔn)品和抗小鼠2ndAb(IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17、TNF-α及IgG1)均購(gòu)自美國(guó)BD公司；辣根過(guò)氧化物酶、濃硫酸、TMB顯色液及吐溫-20購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司。HE染料購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；TB染料購(gòu)自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低壓模擬艙(HCP ⅢD 800)購(gòu)自西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(infinite M200 PRO)購(gòu)自帝肯上海貿(mào)易有限公司，冰凍切片機(jī)(LEICA CM1950)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM2235)均購(gòu)自德國(guó)萊卡儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 低氧動(dòng)物模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為常氧對(duì)照組、低氧7 d組及低氧14 d組，每組小鼠10只。其中，低氧7 d組和低氧14 d組分別在模擬海拔5 000 m低壓氧艙連續(xù)飼養(yǎng)7、14 d后取材，常氧對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)14 d取材。

1.3.2 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

(1)連續(xù)觀察各組小鼠體重的變化；(2)檢測(cè)3組小鼠的紅細(xì)胞壓積；(3)檢測(cè)血清特異性抗體[心臟采血，放置2h后離心(5000r/min)10 min，分離取得血清。以ELISA法檢測(cè)特異性抗體IgG1的含量]；(4)檢測(cè)淋巴細(xì)胞因子[取材前一天用48孔板包被CD3抗體(100μL/孔、5μg/mL)，4 ℃避光過(guò)夜。取材當(dāng)天處死小鼠、消毒，開(kāi)腹取出腸系膜淋巴結(jié)。研磨腸系膜淋巴結(jié)組織，用70 μm尼龍細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾制備淋巴細(xì)胞懸液。取出細(xì)胞(5×106)溶于1 mL cDMEM溶液中。包被好的48孔板用PBS漂洗一次，加入細(xì)胞(5×106)，置于37 ℃培養(yǎng)箱(5% CO2)，72 h后抽取培養(yǎng)液上清置-20 ℃冰箱凍存。以ELISA法檢測(cè)Th1細(xì)胞因子IFN-γ、Th2細(xì)胞因子IL-4、Th17細(xì)胞因子IL-17、Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞均可分泌的細(xì)胞因子IL-10以及TNF-α的含量；(5)將結(jié)腸組織HE染色[取出結(jié)腸約0.5 cm，用OCT包埋，過(guò)液氮，凍存于-60 ℃冰箱。連續(xù)冰凍切片(5μm)后HE染色]；(6)將小腸組織肥大細(xì)胞行TB染色[取出十二指腸中段約0.5cm，浸泡于4%多聚甲醛中，存于4℃冰箱。切片(4μm)后行TB染色]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 短期低壓低氧對(duì)小鼠體重的影響

各組小鼠體重如下表，實(shí)驗(yàn)7 d后，低氧組小鼠體重低于常氧對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)14 d后，低氧組小鼠體重顯著低于常氧對(duì)照組(P<0.05)(表1)，提示短期低壓低氧會(huì)使小鼠體重明顯降低。

Table 1Effect of short-term hypobaric hypoxia on body weight of

2.2 短期低壓低氧對(duì)小鼠紅細(xì)胞壓積的影響

與常氧對(duì)照組相比，低氧7 d組小鼠紅細(xì)胞壓積無(wú)顯著性變化，低氧14 d組紅細(xì)胞壓積略有升高(表2)，提示短期低壓低氧刺激會(huì)使小鼠紅細(xì)胞增多，紅細(xì)胞壓積升高。

Table 2Effect of short-term hypobaric hypoxia on hematocrit in

*：與低氧7 d組相比，P<0.05；#：與常氧對(duì)照組相比，P<0.05

2.3 短期低壓低氧對(duì)小鼠血清IgG水平的影響

與常氧對(duì)照組相比，低氧7 d組與低氧14 d組小鼠血清中IgG1含量均無(wú)明顯變化；低氧7 d組與低氧14 d組相比，小鼠血清中IgG1含量無(wú)明顯變化(表3)，提示短期低壓低氧對(duì)血清中IgG的水平不產(chǎn)生影響。

Table 3Effect of short-term hypobaric hypoxia on serum IgG1 levels in

2.4 短期低壓低氧對(duì)腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

與常氧對(duì)照組相比，低氧7 d組小鼠T淋巴細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10、IL-17及IFN-γ的含量無(wú)明顯變化，TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；低氧14 d組小鼠T淋巴細(xì)胞分泌的IL-4含量無(wú)明顯變化，IL-10及TNF-α含量明顯升高(P<0.05)，IL-17及IFN-γ含量明顯降低(P<0.05)；低氧14 d組與低氧7 d組相比，IL-4及TNF-α含量無(wú)明顯變化，IL-10含量明顯升高(P<0.05)，IL-17及IFN-γ含量明顯降低(P<0.05，表4)，提示短期低壓低氧會(huì)對(duì)小鼠腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生影響。

Table 4Effect of short-term hypobaric hypoxia on cytokine secretion by T lymphocytesin mouse mesenteric lymph

*：與低氧7 d組相比，P<0.05；#：與常氧對(duì)照組相比，P<0.05

2.5 小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果提示，常氧對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織未見(jiàn)任何病理變化；低氧7 d組結(jié)腸無(wú)明顯病理變化；低氧14 d組結(jié)腸黏膜上皮出現(xiàn)輕微破損、黏膜固有層出現(xiàn)輕微水腫情況(圖1)。

A：正常對(duì)照組，B：低氧7 d組，C：低氧14 d組

圖1小鼠結(jié)腸組織HE染色(10×)

Figure1HE staining of Mouse colon(10×)

2.6 小鼠小腸組織肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果提示，常氧對(duì)照組小鼠小腸組織肥大細(xì)胞數(shù)量較少，未見(jiàn)明顯聚集現(xiàn)象且肥大細(xì)胞主要呈未脫顆粒狀態(tài)；低氧7 d組小鼠小腸可見(jiàn)散在肥大細(xì)胞，部分呈脫顆粒狀態(tài)；低氧14 d組小鼠小腸組織肥大細(xì)胞主要呈脫顆粒狀態(tài)(圖2)。

A：正常對(duì)照組，B：低氧7d組，C：低氧14d組

圖2小鼠小腸組織甲苯胺藍(lán)染色圖(40×)

Figure2TB staining of Mouse small intestine(40×)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧14 d組小鼠紅細(xì)胞壓積明顯升高。有研究指出間歇性低氧訓(xùn)練會(huì)使大鼠紅細(xì)胞壓積在1周訓(xùn)練結(jié)束時(shí)略微上升，在第2周上升到較高水平[2]。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，主要由脾臟和淋巴細(xì)胞中的漿細(xì)胞合成，是機(jī)體重要的抗病毒、抗菌和抗毒素抗體。有研究指出，體液免疫以IgG產(chǎn)生為指標(biāo)[3]。本實(shí)驗(yàn)中，3組小鼠血清中IgG含量無(wú)明顯差異，提示短期低壓低氧刺激對(duì)B淋巴細(xì)胞分泌抗體功能影響不明顯。一些研究認(rèn)為，低氧對(duì)IgG水平不產(chǎn)生顯著性影響[4-6]。而有的研究則認(rèn)為低氧可引起IgG水平升高或降低，并且參與到高原低氧的應(yīng)激反應(yīng)中[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧7 d組與常氧對(duì)照組相比，T淋巴細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子無(wú)明顯改變，僅TNF-α的含量略有升高。有研究表明高原低氧環(huán)境中TNF-α水平明顯升高，可能參與了機(jī)體急慢性低氧的應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程[8]。低氧14 d組與常氧對(duì)照組相比，TNF-α及IL-10含量明顯升高，IL-17含量明顯降低，IL-4和IFN-γ含量無(wú)明顯變化。有研究認(rèn)為，通過(guò)缺氧條件刺激，CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的經(jīng)典促炎因子IL-17和IFN-γ產(chǎn)生減少，抑炎因子IL-10產(chǎn)生增多[9]。低氧14 d組與低氧7 d組相比，IL-10、IL-17、IFN-γ及IL-4含量發(fā)生了明顯變化，而TNF-α含量無(wú)明顯變化，正常情況下，機(jī)體Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞處于一種動(dòng)態(tài)平衡。有研究認(rèn)為，低氧刺激主要影響CD4+Th1細(xì)胞的功能，高原低氧暴露可能導(dǎo)致Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答平衡調(diào)節(jié)紊亂[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示短期低壓低氧刺激會(huì)改變小鼠腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫功能，使其Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞亞群的平衡紊亂。

肥大細(xì)胞是一種具有強(qiáng)嗜堿性顆粒的細(xì)胞，主要分布在呼吸道、消化道黏膜和結(jié)締組織中[11]，脫顆粒是肥大細(xì)胞的一種功能狀態(tài)，炎癥性腸病、胰腺炎、食物過(guò)敏及全身性肥大細(xì)胞增多癥的發(fā)病過(guò)程中均可見(jiàn)脫顆粒，而且肥大細(xì)胞脫顆粒還可調(diào)節(jié)正常情況下和炎癥性腸炎中腸道氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，也可引起腸道蠕動(dòng)紊亂。本實(shí)驗(yàn)中短期低壓低氧刺激后，TB染色顯示小腸組織有肥大細(xì)胞脫顆粒的現(xiàn)象，說(shuō)明低壓低氧刺激會(huì)激活肥大細(xì)胞。

綜上所述，短期低壓低氧刺激會(huì)改變小鼠腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫功能，使Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞亞群的平衡紊亂，而對(duì)B淋巴細(xì)胞參與的體液免疫影響不明顯。同時(shí)還會(huì)激活分布于腸道黏膜的肥大細(xì)胞，使其發(fā)揮相應(yīng)的免疫功能。