劉 佳，曹得萍，張雪飛，馬俊英，馬 霄，王永順，雷 雯，王 威，詹培珍，張 震

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海省地方病預(yù)防控制所，青海 西寧 811602；3.青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

包蟲病目前的診斷方式主要為超聲學(xué)檢查，輔助診斷方式為血清學(xué)檢測。但超聲檢查對于操作人員的專業(yè)技術(shù)要求較高，而血清學(xué)檢測方法又存在靈敏度和特異性問題。因此，尋找高靈敏度的早期泡型包蟲病診斷生物學(xué)標(biāo)志物十分必要。本研究采用Illumina高通量測序技術(shù)對泡型包蟲病患者和健康者血清miRNA進(jìn)行檢測，并對差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行初步預(yù)測和功能及通路富集性分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院泡型包蟲病患者血清樣本3例，其中，男性1例，女性 2例，平均年齡為40.33±2.05歲。采集血清前患者均未行任何治療。5例健康對照血清樣本來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康者，其中男性2例，女性3例，平均年齡為40±3.56歲。本研究已獲得青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 血清標(biāo)本處理

在泡型包蟲病患者治療前和健康者體檢時用一次性真空采血管采集空腹外周靜脈血 5 mL離心(2000r/min)8 min，提取血清。

1.2.2 血清miRNA的提取

使用Trizol(美國Thermo Fisher Scientific公司)提取8份血清總RNA。使用超微量紫外分光光度計(NanoDrop ND-2000，美國Thermo Scientific公司)對提取后的樣品總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，RNA的純度以O(shè)D260/OD280值在1.8～2.0之間為合格。將質(zhì)檢合格的樣品送至杭州聯(lián)川生物科技股份有限公司進(jìn)行miRNA高通量測序。

1.2.3 高通量測序及數(shù)據(jù)處理

小RNA文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，USA)試劑盒。文庫制備工作完成后，對構(gòu)建好的文庫使用高通量測序儀(Illumina Hiseq2500)進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)使用ACGT101-miR(LC Sciences，Houston，Texas，USA)軟件進(jìn)行處理。

1.2.4 差異表達(dá)miRNA的篩選

對差異表達(dá)基因的篩選以|log2(Foldchange)|>1(即兩倍差異倍數(shù))且P-value≤0.05為閾值。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用ACGT101-miR(LC Sciences，Houston，Texas，USA)及SPSS18.0(IBM，USA)軟件進(jìn)行。

1.2.5 靶基因的預(yù)測及功能與通路富集性分析

使用TargetScan[1-3]、miRanda[4-6]兩款軟件對顯著性差異的miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測，最后取此兩款軟件的交集作為差異miRNA靶基因。對靶基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG Pathway功能注釋。應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行GO和KEGG pathway差異表達(dá)富集分析，以P-value≤0.05為閾值，滿足此條件視作靶基因顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 小RNA長度分布

對高通量測序所得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行長度分布統(tǒng)計，顯示大部分?jǐn)?shù)據(jù)分布在18～26 nt，符合Dicer 酶切割的典型特征，見圖1。

2.2 差異miRNA表達(dá)分析

泡型包蟲病患者與健康者血清中差異表達(dá)的miRNA共有9個(|log2(Foldchange)|≥1，P-value≤0.05)。其中上調(diào)表達(dá)的有1個，下調(diào)表達(dá)的有8個，見表1。

2.3 差異表達(dá)miRNA火山圖分析

通過繪制火山圖以了解差異表達(dá)miRNA的整體分布情況，見圖2。其中橫坐標(biāo)代表miRNA在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)代表miRNA表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性；紅色代表上調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，藍(lán)色代表下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，灰色代表非顯著性差異表達(dá)基因。

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用TargetScan、miRanda兩款軟件對有顯著性差異的miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測，最后取此兩款軟件的交集作為差異miRNA的最終靶基因。GO功能富集分析結(jié)果表明，這些靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生化過程，蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合等分子功能的調(diào)節(jié)，以及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等的構(gòu)成及細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)。將這些靶基因?qū)?yīng)的GO注釋功能按照參與的生化過程、細(xì)胞成分和分子功能分為三類，并且將每一類中的GO功能按照注釋到的靶基因個數(shù)從高到低排序并做圖，橫坐標(biāo)是GO功能注釋分類，縱坐標(biāo)是靶基因所占百分比，見圖3。

圖1小RNA長度分布圖

Figure1Length distribution of small RNA

表1泡型包蟲病患者與健康者血清差異表達(dá)miRNA

Table 1Serum miRNAs differential expression between patients with alveolarechinococcosis and healthy

圖2差異表達(dá)miRNA火山圖

Figure2volcano of deferentially expressed miRNAs

圖3 GO富集性柱狀圖

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，這些由差異性miRNA調(diào)節(jié)的靶基因主要參與MAPK信號途徑、鈣離子信號途徑、mTOR信號途徑等信號通路。此外，這些靶基因在黏著斑連接、膽堿代謝及細(xì)胞吞噬等功能中富集程度較大。將KEGG通路富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示：富集系數(shù)(Rich Factor)表示位于該KEGG的差異基因數(shù)/位于該KEGG的總基因數(shù)，Rich Factor值越大，KEGG富集程度越大，見圖4。圖5、6分別是靶基因參與的MAPK信號途徑與鈣離子信號途徑的KEGG信號通路分析圖。其中紅色方框?yàn)楸磉_(dá)差異miRNA調(diào)控的靶基因。

圖4KEGG富集性散點(diǎn)圖

Figure4KEGG enrichment scatterplot

圖5 MAPK信號通路分析圖

圖6 鈣離子信號通路分析圖

3 討論

miRNA是真核生物中一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，其長度為18～25個核苷酸。miRNA通過抑制或降解與其相對應(yīng)的靶基因的翻譯功能，從而參與疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等的各個階段[7]。此外，在疾病的每個階段除有與miRNA相對應(yīng)的靶基因發(fā)生改變外，也有調(diào)控這些靶基因的miRNA發(fā)生變化[8-9]。有文獻(xiàn)也認(rèn)為，在寄生蟲病中，宿主miRNA的表達(dá)譜通常會在感染寄生蟲后發(fā)生改變[10]。目前有關(guān)泡型包蟲病患者血清特異性miRNA的研究罕有報道，故本研究以泡型包蟲病患者血清中miRNA的表達(dá)差異情況作為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行初步研究分析。

本次研究使用高通量測序方法檢測了泡型包蟲病患者與健康者血清中miRNA的表達(dá)情況，其中有9個血清miRNA呈差異表達(dá)，提示泡型包蟲病患者血清和健康者血清miRNA的表達(dá)具有差異性。產(chǎn)生這種差異性的原因可能為：一是由于宿主自身組織細(xì)胞中的miRNA因?yàn)楦腥炯纳x而發(fā)生改變，進(jìn)而影響血清中miRNA的表達(dá)量；二是由于寄生蟲在感染宿主后，可以將其自身miRNA釋放至宿主血液中，進(jìn)而導(dǎo)致宿主血清miRNA改變[11]。

本研究通過對有差異性miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因參與的主要功能中，蛋白結(jié)合功能與寄生蟲病發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示，寄生蟲代謝產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)可作用于宿主并與寄生蟲的侵襲有關(guān)[12]。另有研究表明，寄生蟲可通過攝取宿主體內(nèi)的蛋白質(zhì)來減輕發(fā)生在宿主體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而建立長期感染[13]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異性miRNA調(diào)控的靶基因主要參與的通路為MAPK信號途徑與鈣離子信號途徑。MAPK信號途徑是在肝臟的纖維化發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用的途徑[14]，鈣信號途徑中發(fā)揮重要作用的Ca2+信號蛋白在寄生蟲病的免疫調(diào)控機(jī)制中起關(guān)鍵作用[15]，而泡型包蟲病的主要發(fā)病部位為肝臟，其病理表現(xiàn)為泡球蚴寄生部位的組織常發(fā)生壞死、周圍因存在淋巴細(xì)胞和其他組織細(xì)胞的浸潤而伴有慢性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致周圍組織的纖維化和鈣化。

綜上所述，本研究表明，泡型包蟲病患者血清miRNA的表達(dá)具有差異性。經(jīng)本研究篩選出的泡型包蟲病患者血清差異表達(dá)的miRNA可能能夠作為泡型包蟲病早期診斷的新的生物標(biāo)志物。GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果提示血清差異性miRNA調(diào)控的靶基因與泡型包蟲病的免疫應(yīng)答及病理改變密切相關(guān)，但其關(guān)聯(lián)性仍需進(jìn)一步明確。本研究雖獲得了一些與泡型包蟲病相關(guān)的有意義結(jié)果，但研究樣本數(shù)量小，血清miRNA差異表達(dá)譜及靶基因功能僅作為初步分析，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本對相關(guān)結(jié)果加以驗(yàn)證并進(jìn)行深入探究。