李小靜，劉川川，鮑 金，劉輝琦，劉 杰，曹學(xué)鋒，王生蘭

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

高原性心臟病(high altitude heart disease，HAHD)以慢性低壓低氧引起的肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)為基本特征并呈右心室肥厚或右心功能不全。骨橋蛋白 (osteopontin，OPN)是一種分泌型糖基化磷蛋白，廣泛分布于血管等組織，其作用與細(xì)胞的黏附、遷移和血管的生成等有關(guān)，很多研究已證明OPN可作為PAH治療靶點(diǎn)。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，是預(yù)防和治療心腦血管疾病的重要化學(xué)預(yù)防劑。有研究表明，Res可以降低不同組織細(xì)胞中OPN的表達(dá)[1，2]，但Res對(duì)PASMC OPN的表達(dá)是否有抑制作用？本研究探討Res對(duì)低氧條件下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞OPN表達(dá)及細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

ɑ-SMA一抗購(gòu)于武漢博士德公司；ɑ-Tubulin一抗購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；OPN 抗體購(gòu)于Abcam公司；Gibco 胎牛血清購(gòu)于賽默飛公司；白藜蘆醇購(gòu)于生工生物工程公司；MTS試劑購(gòu)于Promega公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于賽默飛公司。三氣培養(yǎng)箱購(gòu)于TECAN公司；ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)于Applied Biosystems公司；Nanodrop 2000購(gòu)于賽默飛公司。

SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)于甘肅省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001]，6周齡，雌雄各半，體重約180 g±20 g。

1.2 鑒定方法

用3%苯巴比妥行腹腔注射麻醉大鼠后再用75%乙醇浸泡數(shù)秒后置于超凈臺(tái)。用手術(shù)剪迅速剖開(kāi)大鼠胸腔，取出心肺組織，放入4 ℃預(yù)冷PBS緩沖液中洗去組織中的血液，剔除心臟，沿肺動(dòng)脈主干逐級(jí)分離出肺動(dòng)脈分支，取 2～3級(jí)肺動(dòng)脈用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下用刀片輕輕刮除肺動(dòng)脈內(nèi)層內(nèi)皮組織和外層纖維外膜，用組織剪將剩余中間層肺動(dòng)脈平滑肌剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊放入培養(yǎng)瓶中(含3mL20% FBS的DMEM液)浸潤(rùn)，先將培養(yǎng)瓶直立放置于常氧培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2/20% O2)中培養(yǎng)，6 h后水平放置繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)出密度約80%時(shí)，用α-actin免疫組化法鑒定為平滑肌細(xì)胞后將其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3～6代的PASMC用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 將常氧組、低氧組、低氧+0.1%DMSO組、低氧+ Res不同劑量(10、25、40、80、100、150、200μM劑量)組培養(yǎng)24 h和48 h后的PASMC用MTS法篩選Res對(duì)PASMC的最佳抑制濃度。

1.3.2 將常氧組、低氧對(duì)照組、低氧+0.1%DMSO組、低氧+ Res低劑量組、低氧+Res高劑量組中的常氧組置于常氧培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2/20% O2)中，低氧組置于低氧培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2/2% O2)中，培養(yǎng)24 h和48 h后的PASMC用于qRT-PCR、western blot、MTS檢測(cè)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 Res對(duì)PASMC的最佳抑制濃度篩選方法

采用不同濃度梯度的Res對(duì)低氧條件下的PASMC進(jìn)行干預(yù)，用MTS法篩選出Res對(duì)低氧PASMC有抑制作用的最低劑量和最高劑量濃度：培養(yǎng)瓶對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，每組6個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理6 h后進(jìn)行不同濃度的Res干預(yù)，將常氧組置于常氧培養(yǎng)箱(5% CO2/20% O2)培養(yǎng)，低氧組置于低氧培養(yǎng)箱(5% CO2/2%O2)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入MTS溶液20 μL，繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值(波長(zhǎng)490nm)。

1.5 PASMC OPN表達(dá)量的檢測(cè)方法

1.5.1 用qRT-PCR法檢測(cè)PASMC OPN mRNA表達(dá)量：用Tirzol 法提取各組PASMC總RNA、Nanodrop 2000軟件測(cè)定總RNA濃度、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。每組取1000 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 用PCR儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1[3]，擴(kuò)增條件： 起始模板變性：50 ℃ 2 min(1cyscle)；94 ℃ 15 min(1cyscle)；在PCR循環(huán)中行模板變性：94 ℃ 10 s；退火、延伸：60 ℃ 34 s(40cyscle)。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1OPN和18S基因PCR特異性引物序列

Table 1PCR specific primer of OPN and 18S gene

1.6 PASMC 功能的檢測(cè)方法

1.6.1 用MTS法檢測(cè)各組PASMC增殖力：對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的PASMC用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，每組重復(fù)6次。常氧組置于常氧培養(yǎng)箱(5%CO2/20% O2)培養(yǎng)，低氧組置于低氧培養(yǎng)箱(5%CO2/2%O2)培養(yǎng)，24 h和48 h后每孔加入MTS溶液20 μL，繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值(波長(zhǎng)490nm)。

1.6.2 用細(xì)胞劃痕法檢測(cè)各組PASMC遷移力：培養(yǎng)的PASMC用胰酶消化，離心(5000r/min)5 min，先用marker筆在6孔板背面用直尺均勻劃?rùn)M線，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105個(gè)/孔后接種于6孔板中。常氧組置于常氧培養(yǎng)箱中、低氧組置于低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)菌槍頭比著直尺垂直于背面的橫線均勻劃痕，加入無(wú)血清培養(yǎng)基用倒置顯微鏡觀察拍照，按以上分組進(jìn)行Res干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，用倒置顯微鏡觀察并拍照。采用image J軟件分別測(cè)量各組0、24、48 h的劃痕寬度，平均遷移距離=(0h的劃痕寬度-24h或48h的劃痕寬度)/2。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)PASMC的最佳抑制濃度

不同濃度的Res處理低氧條件下的PASMC 24、48 h后，可見(jiàn)Res在25、40、80、100、150、200 μM劑量時(shí)對(duì)PASMC有明顯增殖抑制效應(yīng)(P<0.05)(表2)，顯示Res對(duì)PASMC的增殖有一定抑制作用，且抑制作用呈時(shí)間、濃度依賴性。依據(jù)上述結(jié)果選用25、100 μM Res用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Table 2Different concentrations of Res inhibited the proliferation of

#：與Res(0μM)組比較，P<0.05

2.2 Res抑制低氧條件下PASMC OPN mRNA的表達(dá)水平

通過(guò)低氧條件下低劑量(25μM)和高劑量(Res 100μM)對(duì)PASMC干預(yù)24、48 h，用qRT-PCR法檢測(cè)Res對(duì)PASMC OPN mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)Res干預(yù)組PASMC OPN mRNA的表達(dá)量明顯低于低氧組(P<0.05)(表3)，說(shuō)明Res能夠抑制PASMC OPN mRNA的表達(dá)。

Table 3Relative expression of PASMC OPN

#：與低氧組比較，P<0.05

2.3 Res抑制低氧條件下PASMC OPN 蛋白的表達(dá)水平

采用western-blot法檢測(cè)PASMC中OPN蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)，Res低劑量(25μM)和Res高劑量組(100μM)干預(yù)后PASMC OPN蛋白的表達(dá)量明顯低于低氧組(P<0.05)，說(shuō)明Res能抑制低氧條件下PASMC OPN蛋白的表達(dá)，且抑制效果與時(shí)間相關(guān)。

圖1PASMC OPN 蛋白表達(dá)(24h)圖

Figure1PASMC OPN protein expression(24h)

圖2 PASMC OPN蛋白表達(dá)(48h)圖

Table 4Expression amount of PASMC OPN

#：與低氧組比較，P<0.05

2.4 Res抑制低氧條件下PASMC的增殖能力

采用MTS法檢測(cè)PASMC的增殖情況，發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)24、48 h時(shí)Res高劑量組(100μM)與低氧組比較差異有顯著性(P<0.05)，說(shuō)明高劑量Res能夠抑制低氧條件下PASMC的增殖。

Table 5Proliferation of

#：與低氧組比較P<0.05

2.5 Res抑制低氧條件下PASMC的遷移力

通過(guò)低劑量和高劑量Res干預(yù)PASMC 24、48 h可見(jiàn)，低氧組與常氧組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且低氧組較常氧組平均遷移距離增加，說(shuō)明低氧能促進(jìn)PASMC遷移；低氧+Res(25μM)組和低氧+Res(100μM)組與低氧組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且均較低氧組平均遷移距離減少(P<0.05)，說(shuō)明Res能抑制低氧條件下PASMC的遷移。

圖3細(xì)胞劃痕圖

Figure3Cell scratch map

Table 6Migration distance of

#：與低氧組遷移距離比較，P<0.05

3 討論

PAH是由低氧引起的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、中膜平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而導(dǎo)致肺血管收縮、肺動(dòng)脈阻力增加和血管重塑的一種血管性疾病。已有研究表明，慢性缺氧性PAH病理變化的形成與內(nèi)源性內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-1、血管緊張素Ⅱ、血清素、前列環(huán)素、一氧化氮、血小板轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的金屬蛋白酶等有關(guān)[4-6]，但PASMC的增殖、遷移、血管重塑在PAH發(fā)生中的確切機(jī)制仍不完全清楚。本課題組前期通過(guò)慢病毒干擾PASMC OPN的表達(dá)觀察低氧條件下大鼠PASMC OPN表達(dá)以及增殖情況，發(fā)現(xiàn)低氧可使OPN表達(dá)量增加且低氧能促進(jìn)PASMC的增殖，干擾OPN基因后可抑制低氧PASMC的增殖[3]。

通過(guò)培養(yǎng)PASMC 24、48 h發(fā)現(xiàn)，低氧組與常氧組比較，其PASMC OPN的表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明低氧可誘導(dǎo)PASMC OPN表達(dá)增加，與本課題組前期研究[3]以及Irshad K[7]的結(jié)果一致，證明缺氧是促進(jìn)PASMC OPN表達(dá)的重要因素。

徐觀輝[1]等通過(guò)Res對(duì)黑素瘤細(xì)胞株的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Res能顯著減少黑素瘤細(xì)胞株OPN mRNA和蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Res干預(yù)低氧條件下的PASMC，發(fā)現(xiàn)Res可明顯降低PASMC OPN mRNA和蛋白的表達(dá)量，與上述Res能明顯抑制OPN mRNA和蛋白表達(dá)的結(jié)果一致。

陳莉延[8]等通過(guò)對(duì)低氧加Res組和單純低氧組大鼠肺動(dòng)脈壓力和肺小血管中膜厚度、面積的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以低氧加Res行干預(yù)處理，其肺動(dòng)脈壓力和肺血管重塑明顯輕于單純低氧組。周志宏[9]等也證明了Res具有抗動(dòng)脈重塑作用，這說(shuō)明Res對(duì)PAH的形成有抑制作用。目前Res抑制PAH形成的研究大多數(shù)圍繞大鼠整體水平的研究，Res對(duì)PASMC的研究較少報(bào)道。有研究證明Res能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[10]，另外Res對(duì)多種肺癌細(xì)胞有明顯的抑制增殖、侵襲力作用[11-12]，羅猛[13]等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制OPN基因能降低肺癌細(xì)胞侵襲能力，說(shuō)明OPN對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力有重要影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Res能降低OPN的表達(dá)能力且能抑制低氧條件下PASMC的增殖和遷移，因此Res通過(guò)降低低氧條件下OPN的表達(dá)而起到抑制PASMC增殖和遷移作用，其具體調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。