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        低氧在Erastin 誘導(dǎo)的胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞鐵死亡中的作用及其機(jī)制

        2021-07-29 08:42:04高欽玥吳琪煒魏士杰龔愛華朱海濤王冬青
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年18期
        關(guān)鍵詞:意義差異

        高欽玥 宋 廉 吳琪煒 魏士杰 劉 賽 龔愛華 朱海濤 王冬青

        1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科,江蘇鎮(zhèn)江 212000;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212000

        鐵死亡,2012 年新定義的一種細(xì)胞程序性死亡[1],由鐵依賴性的磷脂過氧化物堆積引起[2-3]。正常生理?xiàng)l件下,谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)以還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)為底物將細(xì)胞毒性的過氧化脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒的脂醇[4],當(dāng)小分子化合物Erastin 作用谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(XC-系統(tǒng))時(shí)[5-6],抑制胱氨酸轉(zhuǎn)入導(dǎo)致還原型GSH 合成降低并引起GPX4 活性下降[7-8],最終胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物不能被及時(shí)清除發(fā)生鐵死亡[9]。胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adeno carcinoma,PDAC)已被證實(shí)依賴半胱氨酸代謝預(yù)防活性氧(reactive oxygen species,ROS)過多誘發(fā)的鐵死亡,抑制XC-系統(tǒng)藥物可能成為臨床PDAC 治療的重要手段[10-11]。但低氧是PDAC 藥物治療抵抗原因之一[12-13],低氧是否引起PDAC 中的Erastin 的耐藥及其具體機(jī)制仍需驗(yàn)證。本研究將Erastin 用于低氧培養(yǎng)的PDAC 細(xì)胞中檢測鐵死亡指標(biāo)變化,并探討低氧通過調(diào)控去乙酰酶Sirtuin3(SIRT3)影響鐵死亡的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

        人PDAC 細(xì)胞株P(guān)ANC1,鼠PDAC 細(xì)胞panc02(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所);DMEM 高糖培養(yǎng)基(SH30243.01),PBS(SH30256.01)購于美國Hyclone 公司;澳洲胎牛血清(10099141)購于美國Gibco 公司;鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1(HY-100579),壞死挽救劑Necrostatin-1(HY-15760),凋亡挽救劑Z-VAD-FMK(HY-16658B),SIRT3 抑制劑3-TYP(HY-108331),Erastin(HY-15763)購于美國Med Chem Express 公司;引物合成于上海生工公司;6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3516)、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3599)購于美國Corning 公司;CCK-8試劑盒(CK04)購于日本同仁化學(xué);BCA 蛋白檢測試劑盒(23227)購于Thermo Fisher Scientific 公司。多功能酶標(biāo)儀800 TS 購于美國Bio Tek 公司;倒置熒光顯微鏡Axio Observer A1 購于蔡司公司;RT-qPCR 儀CFX96 購于美國Bio-Rad 公司;臺式離心機(jī)購于Thermo Fisher Scientific 公司。

        1.2 研究方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PANC1、panc02 用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng),常規(guī)傳代,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。低氧培養(yǎng):細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)盒,充入低氧混合氣(1%O2,5%CO2,94%N2,南大恒通氣體廠),充氣10 min 放入37℃培養(yǎng)箱,隔天換氣1 次。

        1.2.2 細(xì)胞活性檢測 取對數(shù)生長期PANC1,panc02細(xì)胞接種于96 孔板,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,每孔2000 個(gè)細(xì)胞;次日細(xì)胞貼壁后,經(jīng)DMSO 或Erastin(5.0 μmol/L)處理,分別置于常氧和低氧培養(yǎng)條件;72 h 后,吸凈上清,將100 μL 培養(yǎng)基添加10 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8(cell counting kit-8,CCK8)的混合溶液加入每孔,常氧或低氧孵育1~2 h,酶標(biāo)儀測定450 nm 處各組的OD 值。其他藥物處理濃度分別為Ferrostatin-1(1 μmol/L),Necrostatin-1(1 μmol/L),Z-VAD-FMK(1 μmol/L),SIRT3 抑制劑3-TYP(20.0 nmol/L)。

        1.2.3 RT-qPCR 檢測SIRT3 mRNA 的表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的PANC1 細(xì)胞種于六孔板中,經(jīng)DMSO 和Erastin(5.0 μmol/L)分別處理后放入常氧和缺氧培養(yǎng)條件,孵育72 h 用TRIzol 試劑提取總RNA,按照試劑盒說明書得到cDNA(K1691,Thermo ScientificTM)。反應(yīng)條件:95℃5 s,61.7℃30 s,72℃30 s,共40 個(gè)循環(huán)。SIRT3 引物序列為5’-GCATTCCAGACTTCAGATCGC-3’,5’-GTGGCAGAGGCAAAGGTTCC-3’,以ACTB 基因?yàn)閮?nèi)參照(5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’,5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’),每個(gè)基因設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,使用2-ΔΔCt值計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

        1.2.4 MDA 和還原性GSH 測定 細(xì)胞培養(yǎng)方式和處理時(shí)間同“1.2.3”,根據(jù)產(chǎn)品說明書使用丙二醛(MDA)檢測試劑盒(A003-1,南京建成)和微量還原型GSH(A006-2,南京建成)測定MDA 和還原型GSH 的相對濃度,BCA法測定樣品的蛋白濃度。

        1.2.5 小鼠模型 C57 老鼠購于江蘇大學(xué)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2018-0010,合格證編號:202010408。飼養(yǎng)條件:相對濕度40%,溫度26℃,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。低氧或常氧預(yù)培養(yǎng)72 h 的panc02 細(xì)胞(每只5×105細(xì)胞)皮下注射到雌性C57 左后側(cè)造模。采用隨機(jī)數(shù)字表法分組(共20 只,每組5 只):①常氧DMSO 組:注射等體積DMSO;②常氧Erastin組:注射15 mg/kg Erastin 溶液;③低氧DMSO 組:注射等體積DMSO;④低氧Erastin 組:注射15 mg/kg Erastin 溶液。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約80 mm3時(shí),治療14 d,隔2 d 注射1 次。通過測量腫瘤重量、長度(L)和寬度(W)監(jiān)測小鼠腫瘤的生長;基于卡鉗測量的腫瘤體積采用修正橢球公式計(jì)算[腫瘤體積=1/2(LW2)]。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)PANC1 細(xì)胞鐵死亡的效果

        常氧Erastin 組加入Ferrostatin-1 的細(xì)胞活性高于常氧Erastin 組,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。加入Z-VAD-FMK 和Necrostatin-1 的細(xì)胞活性與常氧Erastin 組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),見圖1A。低氧Erastin 組的細(xì)胞活性及還原型GSH 相對含量高于常氧Erastin 組,MDA 相對含量低于常氧Erastin 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),見圖1B~D。

        圖1 低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC 細(xì)胞鐵死亡的效果

        2.2 低氧上調(diào)SIRT3 抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC 細(xì)胞鐵死亡的效果

        低氧Erastin 組的SIRT3 mRNA 相對表達(dá)量高于常氧Erastin 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),見圖2A。低氧Erastin 組SIRT3 表達(dá)被抑制后的細(xì)胞活性低于低氧Erastin 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),常氧Erastin 組加或不加3-TYP 的細(xì)胞活性未見變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),見圖2B。

        圖2 低氧上調(diào)SIRT3 抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC 細(xì)胞鐵死亡的效果

        2.3 低氧抑制Erastin 體內(nèi)治療效果

        panc02 的低氧Erastin 組細(xì)胞活性高于常氧Erastin 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),見圖3A。常氧Erastin 組的腫瘤體積小于常氧DMSO 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。低氧Erastin 組的腫瘤大小與低氧DMSO 組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),見圖3B。

        圖3 低氧抑制Erastin 體內(nèi)治療的效果

        3 討論

        本研究中Erastin 引起的細(xì)胞死亡僅可被鐵死亡挽救劑抑制,凋亡和壞死抑制劑不能挽救,且常氧Erastin 組的還原型GSH 相對水平減少,脂質(zhì)過氧化物MDA 增高,符合Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡的特征[14-16]。低氧Erastin 組的細(xì)胞活性水平明顯高于常氧Erastin組。并且低氧Erastin 組內(nèi)抗氧化物還原型GSH 升高,MDA 水平減少,提示低氧Erastin 組的抗氧化水平升高。以上顯示,低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)的PDAC 細(xì)胞鐵死亡。

        Erastin 引起的半胱氨酸缺乏[17]促進(jìn)谷氨酰胺分解引起線粒體膜電位超極化和ROS 增加[18-19]。SIRT3作為重要的線粒體蛋白脫乙酰酶,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平和維持線粒體正常功能[20-21]。SIRT3 mRNA 相對水平在低氧Erastin 組中高于常氧Erastin 組的相對表達(dá)量,且抑制SIRT3 的表達(dá)后,低氧Erastin 組的細(xì)胞活性下降,提示SIRT3 在低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC鐵死亡中發(fā)揮作用。鑒于低氧誘導(dǎo)因子-1α 過表達(dá)細(xì)胞株和化學(xué)性低氧微環(huán)境[22]并沒有真正的氧氣剝奪,本研究根據(jù)文獻(xiàn)提前72 h 低氧預(yù)培養(yǎng)panc02 使細(xì)胞處于慢性低氧狀態(tài)[23-25]。研究結(jié)果顯示,治療第2 周,常氧Erastin 組開始有腫瘤抑制效果,低氧Erastin 組腫瘤體積與低氧DMSO 組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),證實(shí)體內(nèi)低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)的胰腺導(dǎo)管腺瘤鐵死亡。

        綜上所述,本研究首次闡明低氧通過SIRT3 抑制Erastin 誘導(dǎo)的PDAC 鐵死亡,為胰腺癌的臨床治療提供了新思路,但仍有不足之處,未進(jìn)行SIRT3 基因質(zhì)粒干擾驗(yàn)證以及體內(nèi)低氧模型可進(jìn)一步優(yōu)化。

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