張洪波，王建東

武警北京總隊(duì)醫(yī)院 胸外科，北京 100027

在全球范圍內(nèi)，肺癌在發(fā)病率和死亡率方面是最主要的惡性腫瘤，每年有160 萬患者被診斷患有肺癌，超過140 萬患者死于肺癌，其中80%是非小細(xì)胞肺癌，包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌[1-2]。由于肺癌的高死亡率和發(fā)病率，了解和探究肺癌的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)影響腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和遷移能力的新的預(yù)后標(biāo)志物，將有助于制定有效的治療策略，提高肺癌患者的生存率，降低其死亡率[3-4]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類新的非蛋白質(zhì)編碼RNA，最小長度為200 個(gè)核苷酸[5]，它不具有實(shí)質(zhì)性的開放讀框，可以進(jìn)行剪接、加帽和多腺苷酸化[6-7]。最近的研究[8-9]表明，lncRNA 可能具有各種生物學(xué)功能，包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、染色質(zhì)修飾和其他幾種生物學(xué)進(jìn)展。有趣的是，越來越多的研究[10-11]發(fā)現(xiàn)lncRNA 在調(diào)節(jié)各種癌癥類型中許多致癌途徑中起關(guān)鍵作用，通過充當(dāng)腫瘤抑制因子或癌基因而與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。

小核仁RNA 宿主基因17（small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17）位于人 20 號(hào)染色體上，長度為1186 bp。它屬于小RNA的大型非編碼基因家族，例如小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）和微小RNA（microRNA），通常位于宿主基因的內(nèi)含子中。據(jù)報(bào)道，SNHG17 在結(jié)直腸癌和胃癌中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期相關(guān)顯著。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SNHG17 通過抑制p57（細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑1C，CDKN1C）表達(dá)來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡[12-14]。然而，迄今關(guān)于SNHG17 在肺癌中的功能意義以及與p57的表達(dá)關(guān)系尚不清楚。在本研究中，我們探究了SNHG17 在肺癌中的表達(dá)及其與p57的作用關(guān)系，這將可能有助于預(yù)測肺癌患者的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和H1975、人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）；LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol 法 RNA 提取試劑盒、RMPI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（Invitrogen 公司）；Transwell 小室、Matrigel基質(zhì)膠（康寧公司）；CCK-8 試劑盒（上海碧云天公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq（大連 TaKaRa 公司）；GAPDH 抗體（CST 公司）；p57 抗體（Boston 公司）；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（Abcam公司）。

1.2 肺癌組織中SNHG17的組織表達(dá)分析

利用starBase 泛癌分析平臺(tái)（http://starbase.sy?su.edu.cn/panCancer.php）挖掘來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的不同癌癥類型的mRNA 或lncRNA表達(dá)譜。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，添加碳酸氫鈉（22 g/L）、L-谷氨酰胺（0.3 g/L）、青霉素（1 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）和胎牛血清（10%），在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[15]。

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

用TRIzol 試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用 SYBR Premix ExTaq進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 分析，將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的表達(dá)，收集數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，將其相對于閾值循環(huán)（CT）值表達(dá)，轉(zhuǎn)換為倍數(shù)變化。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行分析。用于靶擴(kuò)增的引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.5 細(xì)胞蛋白表達(dá)

采用10% SDS-PAGE 分離細(xì)胞蛋白裂解物，轉(zhuǎn)移至PDVF 膜，與特異性抗體一起孵育，孵育完畢加入化學(xué)顯色液，通過凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）發(fā)光顯色。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種于六孔板，每孔約1×106細(xì)胞。待細(xì)胞融合至80%，用LipofectAMINE 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染20 nmol/L siRNA 到細(xì)胞中，分別作為陰性對照組（NC）、轉(zhuǎn)染組（si-SNGH17+sip57）及轉(zhuǎn)染組（si-SNGH17）。siRNA 序列包括NC-siRNA（正義鏈）（5'-UUGUAAUACACCAAAG UACUG-3'）、SNHG17-siRNA（正義鏈）（5'-GGUG GACCAUGGUGUUCUAdTdT-3'）、p57-siRNA（正義鏈）（GGACCGAAGUGGACAGCGAdTdT-3'）。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以2×103/孔接種于 96 孔板，37℃培養(yǎng) 24、48、72 和96 h 后分別進(jìn)行CCK-8 檢測，即每孔加入10 μL CCK-8，4 h 后在酶標(biāo)儀上測定各孔的D450nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成懸液接種到六孔板中，37℃過夜培養(yǎng)后再培養(yǎng)24 h，稀釋細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞種3 個(gè)小室；將Transwell 小室放入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基的24 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12～24 h 后取出小室；擦去小室內(nèi)表面未穿膜的細(xì)胞，用甲醇固定15 min，DAPI 染核10 min，PBS 洗3 次；于熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

取 60 μL Matrigel 加入 300 μL 無血清培養(yǎng)基中，4℃混勻，加至Transwell 小室，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4～5 h 至基質(zhì)形成固態(tài)，剩余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均表示為x±SD，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG17和p57在肺癌組織中的表達(dá)水平分析

利用 starBase 數(shù)據(jù)庫分析 SNHG17 和 p57 在肺癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)樣本中含有526 例肺腺癌、501 例肺鱗癌，并以相對應(yīng)的正常組織為對照。結(jié)果顯示，SNHG17 在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)含量都高于正常組織（圖1A、C），而p57 在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)量都低于正常組織（圖1B、D）。通過共表達(dá)分析，SNHG17 和 p57 在肺腺癌和肺鱗癌均呈負(fù)相關(guān)趨勢（圖1E、F）。

2.2 SNHG17和p57在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平分析

通過 qRT-PCR 定量檢測 SNHG17 和 p57 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)采用人肺癌細(xì)胞A549、H1975 和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 為細(xì)胞材料。從圖2可見，SNHG17 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于在正常肺細(xì)胞中的表達(dá)，而p57 在2種肺癌細(xì)胞中的表達(dá)卻顯著低于在正常肺細(xì)胞中的表達(dá)，這與肺癌組織中的表達(dá)趨勢一致。說明SNHG17 和p57的表達(dá)可能存在抑制關(guān)系。

2.3 SNHG17沉默抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

為了探究SNHG17 在肺癌細(xì)胞中的作用，選取肺癌細(xì)胞A549 轉(zhuǎn)染si-SNHG17。從圖3可以看出，si-SNHG17 A549 細(xì)胞中的 SNHG17 表達(dá)明顯下調(diào)，而p57的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。同時(shí)，與對照相比，si-SNHG17 A549 細(xì)胞的增殖速度明顯減慢（圖4A），遷移和侵襲能力也受到限制（圖4B、C），而si-p57 和si-SNHG17 同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，si-SNHG17 對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的限制作用得到明顯緩解（圖4）。這些結(jié)果表明SNHG17 表達(dá)下調(diào)使p57的表達(dá)上調(diào)，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；同時(shí)也進(jìn)一步證明SNHG17 可能通過抑制p57的表達(dá)來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的進(jìn)展。

圖1 starBase數(shù)據(jù)庫分析SNHG17和p57在肺癌組織中的表達(dá)差異

3 討論

據(jù)報(bào)道，lncRNA 是幾乎參與所有基因調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子，如表觀遺傳調(diào)控、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[16]。通過這種基因調(diào)控，lncRNA 可以在多種癌中發(fā)揮致癌活性。根據(jù)已有研究，SNHG17 在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并與該病患者的晚期臨床分期和預(yù)后不良相關(guān)，并且通過調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中p57的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖[12]；另有研究表明SNHG17 在胃癌中同樣也高表達(dá)，并通過表觀遺傳調(diào)節(jié)p15 和p57 來促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[13]。然而，SNHG17 在肺癌細(xì)胞進(jìn)展中的作用及與p57的關(guān)系還不清楚。

本研究中，我們首先通過starBase 數(shù)據(jù)庫分析SNHG17 和p57 在肺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SNHG17在肺癌中高表達(dá)，而p57 低表達(dá)，這與在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)一致；隨后的共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)SNHG17和p57的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢，說明SNHG17 可能在肺癌中存在對p57的負(fù)向調(diào)節(jié)。之后，通過沉默SNHG17 研究其對p57 表達(dá)和細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)SNHG17 表達(dá)下調(diào)而p57 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也受到影響，這進(jìn)一步反證了SNHG17 通過調(diào)節(jié)p57 表達(dá)來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

圖2 qRT-PCR檢測SNHG17和p57在人肺癌細(xì)胞A549、H1975和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的相對表達(dá)（*P＜0.05）

圖3 si-SNHG17對A549細(xì)胞中SNHG17和p57表達(dá)的影響（以GAPDH為內(nèi)參基因，*P＜0.05）

圖4 沉默SNHG17對A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（*P＜0.05）

綜上，lncRNA SNHG17 在肺癌中高表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，并通過調(diào)節(jié)p57的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，這與在結(jié)直腸癌和胃癌中的研究結(jié)果一致。本研究為SNHG17 成為肺癌的新的診斷標(biāo)記提供了理論依據(jù)，但SNHG17 和p57 在肺癌中的具體作用機(jī)制仍有待深入探討。