王唯斯，梅雯，孫美濤，李彬，張態(tài)，張若鵬，熊偉

大理大學(xué) a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；b.公共衛(wèi)生學(xué)院；c.第一附屬醫(yī)院；云南 大理 671000

胰腺癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升。中國(guó)每年胰腺癌的診斷和死亡人數(shù)超過(guò)了美國(guó)的病例數(shù)[1]。胰腺癌的發(fā)病率與病死率相近，預(yù)后極差[2]。線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2（mitochondrial transcription termination factor 2，MTERF2）又稱線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子D3（mitochondrial transcription termination domain containing 3，MTERFD3）或線粒體轉(zhuǎn)錄終止樣因子（mitochondrial transcription terminationlike factor，MTERFL），是通過(guò)比較血清培養(yǎng)與血清饑餓培養(yǎng)的人類成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜差異發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞增殖抑制基因[3]。該基因定位于染色體12q24.1，含有4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子，cDNA 序列全長(zhǎng)為1478 bp，編碼385 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)[4]。MTERF2 高表達(dá)于新陳代謝較為旺盛的心臟、肝臟和骨骼肌組織，而在其他組織中表達(dá)水平較低，表明MTERF2 是一個(gè)典型的線粒體蛋白質(zhì)[5-6]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，MTERF2是血清饑餓誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，過(guò)表達(dá)MTERF2 將細(xì)胞周期阻滯于G1/S 期，對(duì)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，但并不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。國(guó)內(nèi)外不同的研究表明，MTERF2 在體內(nèi)與線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的結(jié)合沒(méi)有序列特異性，且抑制線粒體基因的表達(dá)[8-10]。MTERF2 在線粒體內(nèi)的含量相對(duì)豐富，是線粒體擬核的重要組成成分[11]。MTERF2 是參與線粒體基因表達(dá)調(diào)控的重要因子，目前，對(duì)于MTERF2 基因在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義尚不清楚。深入研究胰腺癌的病因及其發(fā)病機(jī)制，尋找高度敏感的分子標(biāo)志物，對(duì)胰腺癌的早期診斷和預(yù)后判斷都具有重要意義。

Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)提取平臺(tái)，是賽默飛公司（Thermo Fisher Scientific）開(kāi)發(fā)的商業(yè)化數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)會(huì)員登陸后可提取腫瘤相關(guān)基因的信息，整合的芯片數(shù)據(jù)以高質(zhì)量得到學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可。目前版本為Oncomine v4.5，包括100 種腫瘤類型、729 個(gè)數(shù)據(jù)集和91 866 個(gè)組織芯片結(jié)果。Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)集合了世界上最全的基因組DNA 拷貝數(shù)、突變、融合基因和mRNA 表達(dá)的芯片和深度測(cè)序結(jié)果[12]。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是目前最大的癌癥基因信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，有全面的癌癥突變譜、基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及相關(guān)的臨床信息。此數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于了解癌細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和新的診斷治療方法有重要意義[13]。

本研究旨在深度挖掘Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的MTERF2 在胰腺癌中的表達(dá)，對(duì)MTERF2 在人類胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)進(jìn)行薈萃分析。利用R 語(yǔ)言軟件從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載胰腺癌患者M(jìn)TERF2的表達(dá)水平及其相關(guān)病例臨床信息進(jìn)行分析，探討MTERF2 在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義，并預(yù)測(cè)MTERF2 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，可根據(jù)需要設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中，我們?cè)O(shè)定的篩選條件為：①Gene：MTERFD3；②Analysis type：Cancer vs.Normal analysis；③Cancer type：Pancreatic can?cer；④Date type：mRNA and DNA；⑤Simple type：Clinical specimen；⑥臨界值設(shè)定條件（Pvalue＜1E-4，fold change 2，gene rank=top 10%）。數(shù)據(jù)輸出保存為Excel 表格。

1.2 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)

從 TCGA（http://tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）數(shù)據(jù)庫(kù)，使用R 2.15.3 軟件Epicalc 函數(shù)包下載并預(yù)處理胰腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA Seq V2 數(shù)據(jù)，進(jìn)行MTERF2 相對(duì)表達(dá)量的分析，同時(shí)下載臨床資料相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行臨床病理相關(guān)性分析。

1.3 數(shù)據(jù)集整理與臨床病理相關(guān)參數(shù)篩選

通過(guò)數(shù)據(jù)下載得到的含有MTERF2 mRNA 表達(dá)量的胰腺癌組織樣本179 例，并有179 例胰腺癌病例相對(duì)應(yīng)的臨床病理資料和預(yù)后資料。通過(guò)對(duì)臨床資料數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選分析，剔除臨床病理資料不全或不完整的病例以及缺乏預(yù)后隨訪資料的病例，僅保留TCGA 數(shù)據(jù)集中包含臨床參數(shù)和生存資料的病例，最后得到含有完整臨床病理參數(shù)和生存資料的病例161 例。根據(jù)mRNA 測(cè)序結(jié)果分析，胰腺癌組織樣本中MTERF2 mRNA 表達(dá)量為 57.3109～786.2748，中位數(shù)為 229.306。某一樣本MTERF2 mRNA 表達(dá)水平大于中位數(shù)，則定義為MTERF2 高表達(dá)，反之則定義為低表達(dá)。根據(jù)這個(gè)定義，乳腺癌組織中MTERF2 高表達(dá)81例，低表達(dá)80 例。

1.4 利用Kaplan-Meier模型進(jìn)行胰腺癌患者生存周期分析

用R 2.15.3 軟件下載胰腺癌患者臨床病例參數(shù)和生存資料，采用Kaplan-Meier 模型，對(duì)胰腺癌患者預(yù)后進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

建立患者臨床資料庫(kù)，將患者年齡、性別、T分期、N 分期、M 分期、AJCC 病理分期、飲酒史、等級(jí)、癌癥類型、組織學(xué)類型、原發(fā)部位和MTERF2表達(dá)水平等指標(biāo)進(jìn)行量化賦值，然后將全部資料輸入計(jì)算機(jī)，用R 語(yǔ)言2.15.3 與GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk 法檢測(cè)胰腺癌組織中MTERF2 mRNA 表達(dá)水平不符合正態(tài)分布，所以胰腺癌組織中MTERF2 表達(dá)水平的比較采用Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗(yàn)。臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)及Fisher 確切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier，單因素和多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTERF2在所有腫瘤類型中的表達(dá)

Oncomine v4.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集了586 個(gè)不同類型的研究結(jié)果，其中關(guān)于MTERF2 表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果共58 個(gè)，MTERF2 表達(dá)增高的研究有26 個(gè)，MTERF2 表達(dá)降低的研究有32 個(gè)（表1）。在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌中高表達(dá)的研究有2 個(gè)、低表達(dá)的有3 個(gè)，胃癌中高表達(dá)的研究有3 個(gè)、低表達(dá)的研究有2 個(gè)，胰腺癌中高表達(dá)的研究有0 個(gè)、低表達(dá)的研究有3 個(gè)，肝癌中的表達(dá)沒(méi)有報(bào)道。

2.2 MTERF2在胰腺癌中的表達(dá)結(jié)果

在Oncomine v4.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中，從2003年開(kāi)始，共有9 個(gè)研究涉及MTERF2 在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)（圖1），包括226 個(gè)樣本。文章分別發(fā)表于Hepatograstroenterology、Oncogenes、Am J Pathol、Cancer Sci、Cancer Cell。薈萃 9 個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，MTERF2 在胰腺癌中低表達(dá)，且具有顯著性差異（P=7.34×10-6）。

2.3 MTERF2在不同胰腺癌研究芯片中癌組織和正常組織之間的表達(dá)差異

分析Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中MTERF2 在不同胰腺癌研究芯片中的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常胰腺組織，胰腺癌組織中MTERF2 mRNA 均呈低表達(dá)（圖2）。

2.4 MTERF2表達(dá)量與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

TCGA 數(shù)據(jù)集中共納入161 例臨床病理參數(shù)完整的病例資料，其中男性89 例、女性72 例，年齡35～88 歲，中位年齡65 歲。對(duì)該數(shù)據(jù)集中宮頸癌患者預(yù)后影響因素進(jìn)行賦值，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析可知，MTERF2 mRNA 表達(dá)水平與胰腺癌患者的T分期、M 分期、癌癥類型及原發(fā)部位顯著相關(guān)（均P＜0.05），而與患者的年齡、性別、N 分期、AJCC病理分期、等級(jí)、組織學(xué)類型及飲酒史無(wú)顯著相關(guān)（均P＞0.05）（表2）。

2.5 MTERF2的表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系

MTERF2 在胰腺癌中表達(dá)水平降低，為了進(jìn)一步明確MTERF2 表達(dá)與胰腺癌預(yù)后之間的關(guān)系，本研究在TCGA 胰腺癌數(shù)據(jù)集中提取了MTERF2 臨床病理相關(guān)參數(shù)，運(yùn)用Kaplan-Meier 模型進(jìn)行分析。如圖3所示，MTERF2 表達(dá)水平在總生存率（overall survival，OS）中與胰腺癌患者預(yù)后情況無(wú)關(guān)（Log-rankP＞0.05），MTERF2 表達(dá)水平在無(wú)病生存率（disease-free survival，DFS）中與胰腺癌患者預(yù)后情況顯著相關(guān)（Log-rankP=0.001）。MTERF2 高表達(dá)的胰腺癌患者無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間比MTERF2 低表達(dá)的患者顯著延長(zhǎng)。

進(jìn)一步對(duì)影響胰腺癌患者生存的因素進(jìn)行單因素和多因素分析（表3）。單因素分析發(fā)現(xiàn)，N 分期和組織學(xué)類型與胰腺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)（均P＜0.05），年齡、性別、T 分期、M 分期、AJCC 臨床分期、等級(jí)、飲酒史和MTERF2 mRNA 表達(dá)量與胰腺癌患者總生存率無(wú)顯著相關(guān)性（均P＞0.05）。對(duì)影響胰腺癌患者生存的因素進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明，組織學(xué)類型與胰腺癌患者無(wú)病生存率顯著相關(guān)（均P＜0.05）。無(wú)論Kaplan-Meier 模型還是COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果都表明MTERF2 在胰腺癌中的表達(dá)量與患者的總生存率無(wú)顯著相關(guān)。

表1 MTERF2在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中所有人類腫瘤相關(guān)研究中的表達(dá)

3 討論

圖1 人MTERF2在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌中的表達(dá)

胰腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其5年生存率低于7%，由于診斷不足和治療效果不佳，嚴(yán)重威脅人類的健康[14]。胰腺癌發(fā)病率逐年提高，在未來(lái)10年內(nèi)將發(fā)展成為人類癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[15]。目前治療仍以爭(zhēng)取手術(shù)切除為主，對(duì)不能手術(shù)者常做姑息性短路手術(shù)、化學(xué)療法和放射治療。然而，由于早期癥狀無(wú)特異性以及早期診斷手段不足，只有15%～20%的患者能夠及時(shí)行根治性手術(shù)，而晚期病人生存率低于30%。與正常人相比，胰腺癌患者的預(yù)期壽命降低了98%[16]。如果能夠早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌，行根治性手術(shù)，病人的生存率將大幅提高[17]。因此，胰腺癌的診治更加注重預(yù)防、早期診斷與治療[1]。但是由于胰腺癌的自身特點(diǎn)，導(dǎo)致其早期診斷難，進(jìn)展到晚期又缺乏有效的治療手段，所以探索胰腺癌不同的分子標(biāo)記物是胰腺癌預(yù)防、早期診斷及治療的重要環(huán)節(jié)。

人MTERF 蛋白家族是一類高度保守的線粒體DNA 結(jié)合蛋白，廣泛存在于后生動(dòng)物與植物中，在人類線粒體基因表達(dá)調(diào)控方面具有重要作用。人 MTERF 蛋白家族有 MTERF1～MTERF4 等 4個(gè)成員，它們?cè)诰€粒體基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[4]。人MTERF2 是線粒體基因表達(dá)的調(diào)控因子之一，可以通過(guò)調(diào)控線粒體氧化磷酸化活性進(jìn)而影響細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[18]。線粒體功能障礙與惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾?。ㄅ两鹕Y、阿爾茨海默癥）、線粒體糖尿病、母系遺傳性耳聾等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[19]。

圖2 Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中MTERF2在不同胰腺癌研究對(duì)列中的表達(dá)（*P＜0.05，**P＜0.01）

本研究首先利用Oncomine 胰腺癌數(shù)據(jù)分析MTERF2 在胰腺癌組織與正常胰腺組織中的差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MTERF2 在胰腺癌組織中呈低表達(dá)。這提示MTERF2 基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用可能類似于抑癌基因，低表達(dá)MTERF2 通過(guò)影響線粒體活性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。同時(shí)，利用TCGA 腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者M(jìn)TERF2的表達(dá)量與相匹配的臨床數(shù)據(jù)參數(shù)進(jìn)一步分析MTERF2 表達(dá)水平與胰腺癌病理特征及預(yù)后的關(guān)系。MTERF 表達(dá)水平與胰腺癌患者T 分期、M 分期、癌癥類型及原發(fā)部位顯著相關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，MTERF2 表達(dá)水平與胰腺癌患者總生存率無(wú)關(guān)，與胰腺癌患者無(wú)疾病進(jìn)展生存率顯著相關(guān)。MTERF2 高表達(dá)的胰腺癌患者無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間比MTERF2 低表達(dá)的患者顯著延長(zhǎng)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析再次證實(shí)，MTERF2 表達(dá)水平并未對(duì)胰腺癌患者的總生存時(shí)間造成影響。

本研究基于Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)與TCGA 癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)，探討了MTERF2 在胰腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義，為進(jìn)一步闡明MTERF2 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，也為臨床胰腺癌的早期診斷和治療提供潛在靶點(diǎn)。

表2 MTERF2表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析（n=161）

圖3 MTERF2表達(dá)狀態(tài)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系

表3 影響胰腺癌患者預(yù)后的臨床病理參數(shù)的單因素和多因素分析