梁爽，楊曉，王俊

軍事醫(yī)學研究院 生命組學研究所，北京 102206

血管發(fā)育過程主要經(jīng)歷2 個階段：血管發(fā)生指來自中胚層的成血管細胞形成原始血管網(wǎng)絡的過程；原始血管叢的內(nèi)皮細胞經(jīng)歷出芽、增殖、修剪等復雜的重塑過程發(fā)育形成成熟血管網(wǎng)絡的過程即為血管形成。腦血管主要通過血管形成過程發(fā)育而成[1]。胚胎期8.5～9.5 d 時腦膜血管叢開始在神經(jīng)管周圍發(fā)育，胚胎期10 d 左右侵入神經(jīng)管，通過血管形成完成神經(jīng)管的血管化。與其他組織血管相比，腦血管在發(fā)育過程中還需要建立獲得獨特的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）。表達豐富的緊密連接及多種轉(zhuǎn)運蛋白的腦內(nèi)皮細胞與覆蓋其外的周細胞、星型膠質(zhì)細胞等共同構(gòu)成了血腦屏障，嚴格控制各種物質(zhì)進出中樞神經(jīng)系統(tǒng)，保障中樞神經(jīng)系統(tǒng)營養(yǎng)與氧氣供應的同時，也保護大腦免受毒素和病原體的侵害，維持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定[2]。此前研究發(fā)現(xiàn)，血腦屏障在胚胎期15.5 d 時開始逐漸發(fā)育成熟，這個過程中緊密連接分子細化、細胞轉(zhuǎn)胞吞過程減少、白細胞黏附分子下調(diào)和外排轉(zhuǎn)運蛋白表達增加[3-6]。然而對這個時期調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞特化的分子機制仍然了解很少。

蛋白精氨酸甲基化是一種普遍的翻譯后修飾，影響包括基因表達、RNA 剪接、DNA 損傷和信號轉(zhuǎn)導在內(nèi)的多種生物學過程[7]。哺乳動物細胞中，蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMT）家族負責將甲基基團從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到精氨酸的氮原子上，其中PRMT5 是主要的Ⅱ型精氨酸甲基酶，是已知惟一的負責對稱二甲基化的家族成員。PRMT5 可以催化多種底物，在細胞的細胞核、細胞質(zhì)及細胞膜都能發(fā)揮重要功能[8-9]。此前已報道，哺乳動物中的PRMT5 可以與MEP50 結(jié)合形成復合體，調(diào)節(jié)組蛋白的H2A、H4R3 和H3R8 甲基化，維持基因在常染色質(zhì)中的穩(wěn)態(tài)，導致靶基因轉(zhuǎn)錄激活或抑制[10]。此前研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育過程中Prmt5的表達特征會隨之改變，提示其在不同發(fā)育階段具有不同功能。如在原始生殖細胞（PGC）中，PRMT5的表達能在細胞質(zhì)和細胞核間轉(zhuǎn)移。PGC 和著床前的胚胎經(jīng)歷了表觀遺傳重編程，PRMT5 在這個過程中從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核（持續(xù)到胚胎期8.5 d）[11-12]。腦血管發(fā)育過程中，內(nèi)皮細胞PRMT5表達特征是否會有變化，Prmt5所介導的精氨酸甲基修飾是否發(fā)揮作用仍未見報道。

本研究中，我們觀察了胚胎期腦血管發(fā)育及BBB 建成過程中關(guān)鍵時間點內(nèi)皮細胞上的PRMT5 表達特征，并初步探索了Prmt5在腦血管內(nèi)皮細胞中的下游靶分子，以期為PRMT5 在腦血管中的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

野生型昆明小鼠購于維通利華公司；bEnd3細胞系為實驗室保存；羊血清工作液、一抗稀釋液、兔二步法試劑盒均購于北京中杉金橋有限公司；ERG（ab92513）、PRMT5（ab109451）、H3R2me2s（ab194684）抗體購于Abcam 公司；IB4（L2140）抗體購于Sigma 公司；流式分選所用抗體CD31（12-0311-81）、7AAD（00-6993-50）均購于eBioscience公司；DMEM 細胞培養(yǎng)基購于Gibco 公司；TRIzol試劑購于 Invitrogen公司；ChIP級蛋白A/G磁珠（26162）購于Thermo 公司。

1.2 小鼠腦組織取材、石蠟包埋及切片

懷孕母鼠斷頸處死，腹部開口，取出完整子宮，置于冰PBS 中。體視鏡下剖取胚胎腦組織，放入4% PFA 中，4℃固定過夜。將固定好的腦組織依次放入濃度為70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇中停留10～15 min，取出后放入二甲苯中10～20 min，中途更換新的二甲苯，最后于60℃將組織置于融化的石蠟中，浸泡80 min，中途換蠟4 次（胚胎期8.5～10.5 d的胚胎此步驟縮短至30 min），最后將組織置于蠟托并加入新的熔蠟，室溫凝固。將蠟塊修整成所需大小，放置在石蠟切片機上并調(diào)整角度進行切片，將形成的蠟帶轉(zhuǎn)移至42℃蒸餾水中，使組織展平，移至載玻片上，37℃干燥過夜。

1.3 免疫熒光

石蠟切片于60℃烘烤30～60 min，脫蠟后系列乙醇復水；將組織切片至于0.1×檸檬酸鹽緩沖液中，高壓修復4 min；PBS 緩沖液浸泡3 次，每次5 min，3% H2O2溶液室溫孵育 15～20 min，PBS 浸泡；山羊封閉液室溫封閉30 min，倒去封閉液，滴加經(jīng)抗體稀釋液適當比例稀釋后的一抗，4℃過夜，PBS 浸泡3 次，每次5 min，滴加相應屬性二抗，37℃孵育1 h，PBS 浸泡3 次，每次5 min，滴加適當比例稀釋的TSA 顯色液顯色，顯色時間依抗體而定。熒光顯微鏡觀察顯色情況。

1.4 胚胎腦內(nèi)皮流式分選

提前打開通風櫥紫外線照射30 min，器械須提前用70%～75%的乙醇浸泡消毒。母鼠斷頸處死后將整個子宮浸泡于冰PBS 中，顯微操作取出胚胎腦組織，置于300 μL 無菌PBS，并放在冰盒上，一支離心管中放入1/2 個腦組織，待取材完畢，每支離心管加入300 μL 0.2%膠原酶H，置于冰上，用鑷子搗碎，37℃消化15 min，重復搗碎及消化步驟直至組織無明顯團塊，加入300 μL 無菌 PBS 終止消化，310 rcf 離心 5 min，去上清，加入 1.5 mL 20% BSA，混勻，310 rcf 離心 10 min，去上清，用 100 μL FBS/PBS 重懸細胞，用 100 目細胞篩過濾，并預留一部分細胞不標抗體作為空白對照。根據(jù)需要標記相應抗體，4℃ 30 min，加入1 mL 0.1% BSA/PBS 終止，離心去上清，100 μL 1% BSA/PBS 重懸，標 7AAD，移入流式管。BD FACSAriall 流式細胞儀上機分選。

1.5 內(nèi)皮細胞RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

將流式分選獲得的內(nèi)皮細胞離心去上清，加入1 mL TRIzol。冰上放置5 min，加入200 μL三氯甲烷，振蕩混勻后室溫放置2～3 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min，吸取上層水相至另一離心管中，加入500 μL 異丙醇，混勻，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min 離心 10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，上下翻轉(zhuǎn)離心管使沉淀懸浮，4℃、7500 r/min 離心 5 min，棄上清。室溫晾干，加入適量DEPC 水溶解，測量RNA 濃度。按如下反應體系進行反轉(zhuǎn)錄：RNA 1 μg，5×RT Mix（Toyobo 公司）4 μL，用 DEPC 水補足20 μL。反應條件：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min。

1.6 實時熒光定量PCR

用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 進行實時熒光定量PCR，體系為cDNA 1 μL、水3.5 μL、引物1 μL、2×Mix 4.5 μL。引物為 PRMT5-s（5'-TTCTTCTC CACAGCATACAG-3'）和 PRMT5-a（5'-GAACCAA CCACTCAG-3'），GAPDH-s（5'-TGCCCAGAACAT CATCCT-3'）和 GAPDH-a（5'-GGTCCTCAGTGTA GCCCAAG-3'）。

1.7 內(nèi)皮細胞干涉、蛋白提取和Western印跡檢測

稀釋 5 μL 小干擾 RNA（siRNA）于 200 μL Jet PRIME 緩沖液中，用槍頭上下混勻，加入與siRNA 等體積的Jet PRIME，渦旋10 s，快速離心，室溫孵育10～15 min，將轉(zhuǎn)染混合物滴加到6 孔板細胞中，輕柔搖勻，孵育48 h。PRMT5 siRNA 靶序列為GCACAGTTTGAGATGCCTT。用細胞刮將6 孔板內(nèi)的bEnd3 細胞收集到1.5 mL 離心管中，加入60 μL RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）。充分超聲波破碎后，4℃、12 000 r/min 離心20 min，吸取上清至新的離心管中，BCA 法測量蛋白濃度。蛋白樣品加入5×上樣緩沖液后煮沸5 min，進行SDS-PACE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，根據(jù)marker 裁取目的條帶，敷上一抗，4℃搖床過夜。PBST 洗3 次，每次5 min，室溫孵育相應屬性二抗 1 h，PBST 清洗 3 次，每次 5 min，顯影。

1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

細胞培養(yǎng)于10 cm 細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基用量為10 mL，加入270 μL 甲醛，輕輕混勻，室溫放置10 min，加入1 mL 甘氨酸緩沖液，輕輕混勻，室溫放置5 min。將培養(yǎng)皿置于冰上，吸凈液體，用冰PBS 洗2 次，細胞刮刮下細胞，置于1.5 mL 離心管中。加入200 μL 溶解緩沖液，冰上放置10 min，超聲波處理，將 DNA 片段斷裂成 200～1000 bp，4℃、15 000 r/min 離心10 min。取上清，置于15 mL 離心管中，加入稀釋緩沖液稀釋至1/10。加入 10 μL 蛋白 A/G 磁珠，4℃轉(zhuǎn)動 30 min，完成預雜交。用磁力架去除磁珠，取10 μL 作為In?put，保存于-80℃，其余加入抗體，4℃孵育過夜。加入25 μL 磁珠，4℃轉(zhuǎn)動4 g，磁力架去除磁珠，用低鹽緩沖液、高鹽緩沖液、LiCl 緩沖液及TE 緩沖液各洗1 次，每次5 min。所有離心管（包括In?put）加入洗脫緩沖液分 2 次補齊到 200 μL，65℃轉(zhuǎn)動各15 min。磁力架去除磁珠，所有離心管加入8 μL 5 mol/L NaCl，65℃水浴過夜。所有離心管加入 1 μL RNaseA，30℃ 30 min，加入 4 μL 0.5 mol/L EDTA，8 μL 1 mol/L Tris-HCl 和1 μL蛋白酶 K，55℃ 30 min。DNA 提純，測濃度。PCR 擴增，引物序列為 Bmp4-s（5'-TACGGAAGG CCACCCTTTAAACCA-3'）和 Bmp4-a（5'-AAATAC CCATGGGAGTCTGGGCTT-3'）。

2 結(jié)果

2.1 PRMT5在腦血管發(fā)育過程中表達位置發(fā)生改變

腦膜血管叢自胚胎期8.5～9.5 d 開始從神經(jīng)管周圍向神經(jīng)管中發(fā)生血管形成過程，胚胎期15.5 d 時BBB 初步建成，至出生時進一步發(fā)育成熟。為了觀察腦血管發(fā)育過程中Prmt5在內(nèi)皮細胞中的表達變化，我們分別取材胚胎期（E）10.5、12.5、14.5、16.5、18.5 d 和出生后 1 d（P1）小鼠腦組織，通過免疫熒光染色觀察不同發(fā)育時期小鼠腦血管內(nèi)皮細胞PRMT5的表達。利用酪氨酸信號放大技術(shù)（TSA）多色熒光標記PRMT5、ERG（ETS related gene，內(nèi)皮細胞核標志物）及IB4（isolectin B4，血管內(nèi)皮標志物）后，我們發(fā)現(xiàn)E8.5時，神經(jīng)管內(nèi)仍缺乏血管的分布，神經(jīng)管邊緣的血管內(nèi)皮細胞核和細胞質(zhì)中均可檢測到PRMT5的表達（數(shù)據(jù)未示）。E10.5 小鼠神經(jīng)管內(nèi)出現(xiàn)血管，PRMT5 在血管內(nèi)皮細胞的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。從E10.5～E18.5，均可檢測到血管內(nèi)皮細胞的細胞核與細胞質(zhì)中PRMT5的表達，且不同區(qū)域中血管內(nèi)皮細胞PRMT5 表達未見顯著差異。小鼠出生后1 d，血管內(nèi)皮細胞PRMT5的胞內(nèi)表達位置發(fā)生明顯變化，主要表達在細胞核中（圖1A）。該結(jié)果表明，胚胎期至圍產(chǎn)期，腦血管內(nèi)皮細胞中PRMT5 表達出現(xiàn)了細胞質(zhì)-細胞核的變化。進一步利用流式分選技術(shù)分離E10.5、E12.5、E14.5、E16.5、E18.5 和 P1 小鼠腦中 CD31（platelet endothelial cell adhesion molecule-1）陽性的原代內(nèi)皮細胞，提取RNA 后實時熒光定量PCR 定量分析Prmt5的表達情況。Prmt5在E18.5時 RNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），而除 E18.5外其他時間點表達量并無明顯變化（圖1B）。

2.2 內(nèi)皮細胞系基因敲降Prmt5調(diào)節(jié)Bmp4表達

圖1 小鼠腦血管發(fā)育過程中內(nèi)皮PRMT5的表達變化

Prmt5在腦血管發(fā)育過程中持續(xù)表達，且表達量和分布隨著發(fā)育時期不同而變化，暗示其在腦血管發(fā)育中發(fā)揮著不同的功能。Prmt5在內(nèi)皮細胞中的功能未見報道，此前研究發(fā)現(xiàn)在多種類型細胞中組蛋白H3R2 和H4R3 是Prmt5的經(jīng)典底物。為了探索Prmt5的功能，我們在腦血管內(nèi)皮細胞系b.End3 中基因敲降Prmt5，檢測腦血管內(nèi)皮細胞中Prmt5介導的組蛋白甲基化產(chǎn)物H3R2me2s 及H4R3me2s 是否受到影響。Western印跡發(fā)現(xiàn)Prmt5基因敲降48 h 后，小鼠腦血管內(nèi)皮細胞H4R3me2s 及H3R2me2s 表達均明顯下降，說明腦內(nèi)皮細胞中這2 種組蛋白分子精氨酸對稱甲基化受Prmt5的調(diào)控（圖2A）。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路在腦血管發(fā)育成熟中發(fā)揮重要作用。此前有研究發(fā)現(xiàn)肺發(fā)育過程中Prmt5可以通過修飾組蛋白H3R2 精氨酸位點，調(diào)節(jié)TGF-β信號通路。為了驗證腦內(nèi)皮細胞中TGF-β信號通路是否受Prmt5調(diào)節(jié)，我們在b.End3 細胞系中基因敲降Prmt5，提取RNA 后通過實時熒光定量PCR 檢測TGF-β信號通路中關(guān)鍵配體TGF-β1、Bmp4、Bmp9，胞內(nèi)信號介導分子Smad4及下游靶分子Id1、Id3和PAI-1的表達，其中Bmp4表達顯著上調(diào)，相應地其下游靶分子PAI-1的表達也顯著升高（P＜0.05）（圖2B）。為進一步驗證與Bmp4啟動子結(jié)合的H3R2 能否被Prmt5對稱二甲基化，我們通過免疫共沉淀實驗，利用H3R2me2s 抗體，發(fā)現(xiàn)Bmp4的啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點上游236～436 bp 區(qū)域具有 H3R2me2s 修飾，Prmt5基因敲降后該組蛋白精氨酸甲基化修飾顯著減少（圖2C）。這些結(jié)果表明內(nèi)皮細胞中H3R2 和H4R3 是Prmt5的作用底物，腦血管內(nèi)皮細胞中Prmt5可能通過對Bmp4啟動子組蛋白H3R2 進行二甲基化修飾，調(diào)節(jié)Bmp4的表達，從而影響TGF-β信號通路。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)了PRMT5 在腦血管發(fā)育及BBB 建成的關(guān)鍵時期存在內(nèi)皮細胞核與細胞質(zhì)之間表達位置和表達量的變化；小鼠腦內(nèi)皮細胞系中PRMT5 可以修飾組蛋白H3R2，Bmp4的啟動子區(qū)域具有H3R2me2s 修飾，Prmt5在腦血管內(nèi)皮細胞中抑制Bmp4的表達。

我們首次研究了Prmt5在腦血管發(fā)育過程中的表達變化，并發(fā)現(xiàn)對血管發(fā)育具有重要作用的Bmp4是Prmt5的下游靶分子。近年來一些研究利用新型測序技術(shù)和基因修飾小鼠模型，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)育時間推移，腦血管內(nèi)皮逐步獲得特化的分子表達特征，從而獲得了獨特的血腦屏障特征。如緊密連接分子occludin、claudin 和 ZO-1 在E12 左右在內(nèi)皮細胞連接處表達，BBB 重要的建成標志分子Mfsd2a 在E15 左右開始表達，一系列配體特異的轉(zhuǎn)運蛋白也在E14.5 左右開始表達。如BBB 特異性外排轉(zhuǎn)運蛋白Pgp 在胚胎發(fā)育過程中表達較低，但出生后發(fā)育過程中表達增加[3-4]。我們發(fā)現(xiàn)在此過程中Prmt5表達也發(fā)生著表達量和表達位置的改變，更重要的是Prmt5可以調(diào)節(jié)TGF-β 信號通路。Bmp4的啟動子區(qū)域具有H3R2me2s 修飾，Prmt5基因敲降后該組蛋白精氨酸甲基化修飾顯著減少。這一作用與在肺分支過程發(fā)現(xiàn)的Prmt5通過甲基化與Bmp4啟動子結(jié)合的H4R3 從而抑制其轉(zhuǎn)錄類似[13]。此前人類和小鼠遺傳學證據(jù)均表明，TGF-β信號通路可以通過調(diào)節(jié)周細胞黏附等多種方式在BBB 發(fā)育成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些結(jié)果暗示蛋白精氨酸甲基化這一表觀遺傳調(diào)節(jié)方式可能通過調(diào)節(jié)TGF-β等在BBB 發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的信號通路，參與調(diào)節(jié)BBB的發(fā)育和成熟[14]。目前表觀遺傳調(diào)節(jié)在血管發(fā)育過程中的功能研究仍十分有限，但近年來一些基于遺傳修飾小鼠的體內(nèi)研究也有重要發(fā)現(xiàn)，例如抑制DNA 甲基化可以促進小鼠胚胎干細胞（mESC）向內(nèi)皮細胞分化[15]。小鼠中組蛋白去乙?；福℉DAC）敲除后會引起血管擴張和破裂，最終導致小鼠胚胎死于妊娠中期[16]。然而目前關(guān)于表觀遺傳修飾對腦血管發(fā)育作用的研究仍很少，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在腦血管內(nèi)皮細胞中的功能也未見報道。Prmt5在BBB 發(fā)育和成熟過程中的功能仍須借助遺傳修飾動物做進一步體內(nèi)研究。

圖2 內(nèi)皮細胞系中Prmt5通過甲基化Bmp4啟動子組蛋白H3R2調(diào)節(jié)Bmp4的表達