王燕 馬金 蘇曉滿 郝英慧

瓊脂是一類以半乳糖為主要成分的一種高分子多糖，瓊脂酶可將瓊膠水解，產(chǎn)生的低聚糖具有重要的生理學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性，益于人類健康。在相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，瓊脂酶也可以從瓊脂糖凝膠當(dāng)中回收DNA、分離海藻中的原生質(zhì)體和研究海藻細(xì)胞壁多糖結(jié)構(gòu)和組成的工具酶。綜上，瓊膠酶具有十分廣闊的研究發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)主要探究Aga0917- PGEX- 4T- 2- BL21（DE3）plySs工程菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的條件優(yōu)化，以獲得大量有活性的重組酶。

實(shí)驗(yàn)方法

生長曲線測定。挑取LB氨芐固體培養(yǎng)基上的Aga0917- PGEX- 4T- 2- BL21（DE3）plySs菌落，接種LB氨芐液體培養(yǎng)基，37℃、170rpm震蕩培養(yǎng)12h，作為種子液。將種子液，按1：100的比例接種LB氨芐液體培養(yǎng)基，37℃、170rpm震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h和13h時取出，以空白培養(yǎng)基為對照，測定600nm處的吸光值。每個時間點(diǎn)設(shè)置三個實(shí)驗(yàn)組。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，繪制基因工程菌株的生長曲線。

瓊膠酶酶活力測定。瓊脂的α- 1，3和β- 1，4糖苷鍵可以被瓊脂酶水解而產(chǎn)生還原性末端。在本實(shí)驗(yàn)中，我們主要利用DNS法測定瓊膠酶活性，即D-半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)，通過分光光度計測得的還原糖增量來定量瓊脂酶活力。向具塞試管中加入1ml 0.1%瓊脂糖底物酶，37℃水浴鍋預(yù)熱，再加入0.25ml粗酶液，37℃水浴30min，加入DNS 1.25ml，煮沸7min，取出冷卻后加入2.5ml蒸餾水，混勻。相同條件下，以空白培養(yǎng)基代替粗酶液組為空白對照，測定OD540值。酶活力（U/ml）定義為，反應(yīng)條件下，每ml反應(yīng)液每分鐘產(chǎn)生1μmol D-半乳糖所需酶量。

粗酶液制備。從固體培養(yǎng)基中刮取少量菌接種到加有Amp的種子液中震蕩培養(yǎng)12h。將種子液以1：100的比例接入發(fā)酵瓶中，37℃、170rpm震蕩培養(yǎng)2h，加入誘導(dǎo)劑IPTG，16℃、170rpm搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。4℃、4000rpm離心10min收集菌體。加入5ml 20mM Tris- HCl（pH8.0）重懸。重懸完畢放于- 80℃冰箱冷凍30min。將解凍后的菌液進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎（180W，7min），于4℃離心機(jī)12000rpm離心30min。收集上清即為粗酶液。

IPTG濃度對菌株產(chǎn)酶酶活性的影響。誘導(dǎo)劑IPTG設(shè)置0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1 mM 七個濃度梯度。根據(jù)1.3部分的描述，制備粗酶液。根據(jù)1.2部分的描述測定各組的酶活力。

種齡的影響。種子液培養(yǎng)時間設(shè)置2h、3h、5h、7h、12h和24h 六個水平。根據(jù)1.3部分的描述，制備粗酶液。根據(jù)1.2部分的描述測定各組的酶活力。

誘導(dǎo)時機(jī)對酶活性的影響。加誘導(dǎo)劑前的培養(yǎng)時間設(shè)置2h、4h、6h、8h與10h 五個水平。根據(jù)1.3部分的描述，制備粗酶液。根據(jù)1.2部分的描述測定各組的酶活力。

誘導(dǎo)時間與溫度的影響。誘導(dǎo)時間設(shè)置8h、16h、24h和36h 四個水平，誘導(dǎo)溫度設(shè)置12℃、16℃、25℃和37℃四個水平。根據(jù)1.3部分的描述，制備粗酶液。根據(jù)1.2部分的描述測定各組的酶活力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

生長曲線的測定

如圖1所示，在2h- 8h時間段為該菌株的對數(shù)生長期，8h之后進(jìn)入穩(wěn)定期。因檢測其吸光值只能檢測到菌體數(shù)量的多少，而分辨不出菌體的活性，故在穩(wěn)定期過后仍然顯示吸光值增加，即在衰退期仍表現(xiàn)出吸光值的增加。在9、10h數(shù)值呈現(xiàn)下降趨勢，其原因可能是測量時誤差造成。

IPTG濃度對酶活性的影響

如圖2所示，經(jīng)DNS法測得當(dāng)濃度為0.01mol/L的IPTG時，OD540值最大，換算為相對酶活力，在該濃度下的酶活力最高。在誤差棒標(biāo)注下，0.005mol/L的IPTG組存在誤差，其可能因?yàn)闇y量時為完全混合均勻，或在酶與底物反應(yīng)時，實(shí)驗(yàn)組加入酶的時間不同，導(dǎo)致酶與底物反應(yīng)時間不同。

種齡對酶活性的影響

如圖3所示，種子液培養(yǎng)時間為2- 7h 間，酶活力隨種子液培養(yǎng)時間，有所上升，5h之后趨勢變緩，在7h處達(dá)到最大，相對酶活力顯示在12h- 24h處數(shù)值有下降趨勢。

誘導(dǎo)時機(jī)對酶活性的影響

如圖4所示，誘導(dǎo)前培養(yǎng)時間在2- 6h階段較為平穩(wěn)且酶活最大，6h之后開始呈現(xiàn)下降趨勢。

誘導(dǎo)時間和溫度對酶活性的影響

如圖5所示，誘導(dǎo)時間為8h時，隨溫度的升高相對酶活緩緩上升，在25- 37℃之間酶活略有降低，但趨勢平緩；誘導(dǎo)時間為16h時，隨溫度的升高，相對酶活呈先下降后上升再下降的趨勢，12- 16℃下降趨勢平緩，16- 25℃上升明顯，且在25℃時相對酶活最高；誘導(dǎo)時間為24h時，整體呈緩緩下降的趨勢；誘導(dǎo)時間為36h時，在12- 25℃呈平緩趨勢，在25℃之后，呈較為明顯的下降趨勢。

誘導(dǎo)溫度為12℃時，培養(yǎng)16h酶活最好；誘導(dǎo)溫度為16℃時，培養(yǎng)16h酶活最高，8h次之；誘導(dǎo)溫度為25℃時，培養(yǎng)16h酶活最大，8h次之；誘導(dǎo)溫度為37℃時，培養(yǎng)時間為8h酶活最好。

綜上所述，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)時間確定時，選擇25℃培養(yǎng)最為適宜；當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度確定時且在25℃以下時，選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)16h最為合適。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度確定時且在25℃以上時，選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)8h最合適。

基金項(xiàng)目：1.本研究由河南省科技計劃項(xiàng)目《碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM）對瓊膠酶Aga0917催化效率的影響》（編號：182102311134）

2.河南省教育廳《河南省高校省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃》（項(xiàng)目編號：201810472018）共同資助完成。

作者簡介：

王燕（1982-），女，漢族，山東聊城人，副教授，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，博士，研究方向：微生物酶資源；馬金（1998-），女，漢族，河南南陽人，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2017級本科在讀，研究方向：微生物；蘇曉滿（1999-），女，漢族，河南洛陽人，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2017級本科在讀，研究方向：微生物酶資源；郝英慧（1999-），女，漢族，河南焦作人，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2017級本科在讀，研究方向：微生物酶資源。