付玉娟，殷濤，倪猛，王旸，萬里新

鄭州大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院1核醫(yī)學(xué)科，3消化內(nèi)科，4放療科，5腫瘤科，河南南陽473000

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科，武漢430000

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展受多種因素的影響，包括遺傳因素和環(huán)境因素等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)[1]。目前，結(jié)直腸癌的常用治療手段是手術(shù)輔以放化療。放療可以有效殺死腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)細(xì)胞周期，提高手術(shù)治療的效果。但部分患者具有較低的放療敏感性，遠(yuǎn)期效果不能達(dá)到預(yù)期，因此研究放療抵抗的分子機(jī)制是目前結(jié)直腸癌臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本文研究結(jié)直腸癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（long noncoding RNA X-inactive specific transcript，lncRNA XIST）的表達(dá)水平，探討其與放療敏感性的關(guān)系及可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

SW480、HT-29、SW620、LOVO細(xì)胞均購(gòu)自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫，正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）、pcDNA、miRNA-34a模擬物和miRNA-34a抑制劑（anti-miRNA-34a）均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒、微小RNA（microRNA，miRNA）提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京博泰生物技術(shù)有限公司，野生型XIST（XIST-WT）和突變型 XIST（XIST-MUT）3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated regin，3'-UTR）熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。流式細(xì)胞儀、qPCR儀均購(gòu)自美國(guó)ABI公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 標(biāo)本選取

選擇2016—2018年南陽市中心醫(yī)院收治的30例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織，所有患者均經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌且未接受放化療，手術(shù)切除組織標(biāo)本后，保存于-80℃冰箱。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待其濃度約為80%，加入胰蛋白酶消化、傳代。將SW480細(xì)胞以2×105/孔接種至6孔板中，將轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-XIST、miRNA-NC、miRNA-34a模擬物、antimiRNA-NC、anti-miRNA-34a、pcDNA-NC、pcDNAXIST的細(xì)胞分別作為si-NC組、si-XIST組、miRNANC組、miRNA-34a組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-34a組、pcDNA組、XIST組；將轉(zhuǎn)染siRNAXIST+anti-miRNA-NC的細(xì)胞作為si-XIST+antimiRNA-NC組，將轉(zhuǎn)染siRNA-XIST+anti-miRNA-34a的細(xì)胞作為si-XIST+anti-miRNA-34a組。待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測(cè)XIST和miRNA-34 a的相對(duì)表達(dá)量

采用RNA提取試劑盒和miRNA提取試劑盒提取組織或細(xì)胞中總RNA和miRNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，XIST上游引物為5'-ACGCTGCATGTGTCCTTAG-3'，下游引物為5'-GAGCCTCTTATAGCTGTTTG-3'；miRNA-34a上游引物為5'-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3'，下游引物為5'-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3'；GAPDH上游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游引物為5'-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3'。 以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算XIST和miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞照射

取si-NC組、si-XIST組以及si-XIST+anti-miRNA-NC組、si-XIST+anti-miRNA-34a組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，采用2、4、6、8 Gy的放射劑量一次性照射48 h，照射完成后置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，進(jìn)行細(xì)胞克隆和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

取si-NC組、si-XIST組以及si-XIST+anti-miRNA-NC組、si-XIST+anti-miRNA-34a組細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆，棄去培養(yǎng)液，采用4%多聚甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，低倍顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)=受照射細(xì)胞克隆形成率/未受照射細(xì)胞克隆形成率×100%。

1.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將si-NC組、si-XIST組以及si-XIST+anti-miRNA-NC組、si-XIST+anti-miRNA-34a組采用4 Gy照射的細(xì)胞接種至6孔板中，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液，加入10 μl異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）和 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.8 XIST靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan，按照操作流程預(yù)測(cè)XIST下游調(diào)控的靶基因。經(jīng)過大量的文獻(xiàn)篩選，選定miRNA-34a作為研究對(duì)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證XIST與miRNA-34a的靶向關(guān)系，構(gòu)建野生型 XIST（XIST-WT）和突變型 XIST（XIST-MUT）的3'-UTR熒光素酶報(bào)告載體，分別共轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物和miRNA-34a抑制劑，測(cè)定雙熒光素酶的活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XIST相對(duì)表達(dá)量的比較

XIST在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（3.508±0.594），高于癌旁組織的（1.068±0.076），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.057，P＜0.05）。結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、HT-29、SW620、LOVO中XIST的相對(duì)表達(dá)量均高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。其中SW480細(xì)胞中XIST的相對(duì)表達(dá)量最高，因此以SW480細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

2.2 下調(diào)XIST表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

si-XIST組SW480細(xì)胞中XIST的相對(duì)表達(dá)量為（0.293±0.020），低于si-NC組的（0.968±0.049），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.09，P＜0.05）。si-NC組SW480細(xì)胞的凋亡率為（6.553±0.342）%，明顯低于si-XIST組的（23.436±1.401）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.28，P＜0.01）（圖1）。照射劑量為 4、6、8 Gy時(shí)，si-XIST組SW480細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)均低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表1 各細(xì)胞系中XIST相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 各細(xì)胞系中XIST相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：*與NCM460細(xì)胞比較，P＜0.05

細(xì)胞系NCM460 SW480 HT-29 SW620 LOVOXIST相對(duì)表達(dá)量1.086±0.084 4.120±0.368*1.966±0.182*2.123±0.241*3.125±0.323*

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示，XIST與miRNA-34a的3'-UTR的部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)（圖2）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-34a組XISTWT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性低于miRNA-NC組，anti-miRNA-34a組XIST-WT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性高于anti-miRNANC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miRNA-34a組和miRNA-NC組XIST-MUT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；anti-miRNA-34a組和anti-miRNA-NC組XISTMUT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW480細(xì)胞的凋亡情況

表2 不同照射劑量si-NC組和si-XIST組SW480細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（%）

2.4 miRNA-34 a相對(duì)表達(dá)量的比較

圖2 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miRNA-34 a與XIST間的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表3 不同組別XIST-WT和-XIST-MUT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性（x± s）

miRNA-34a在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.482±0.110），低于癌旁組織的（1.146±0.078），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.529，P＜0.05）。結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、HT-29、SW620、LOVO中miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)量均低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。

2.5 XIST與miRNA-34 a相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，XIST組的miRNA-34a相對(duì)表達(dá)量為（0.256±0.017），低于pcDNA組的（1.003±0.086），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.76，P＜0.05）；si-XIST組的miRNA-34a相對(duì)表達(dá)量為（3.459±0.352），高于si-NC組的（0.986±0.094），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.76，P＜0.05）。

表4 各細(xì)胞系中miRNA-34 a相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表4 各細(xì)胞系中miRNA-34 a相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：*與NCM460細(xì)胞比較，P＜0.05

細(xì)胞系NCM460 SW480 HT-29 SW620 LOVO miRNA-34a相對(duì)表達(dá)量0.983±0.099 0.256±0.027*0.593±0.059*0.452±0.046*0.368±0.038*

2.6 anti-miRNA-34 a逆轉(zhuǎn)si-XIST增強(qiáng)SW480細(xì)胞輻射敏感性的能力

照射劑量為2、4、6、8 Gy時(shí)，si-XIST組SW480細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)均低于si-NC組，si-XIST+anti-miRNA-34a組SW480細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)均高于si-XIST+anti-miRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表5）。si-XIST 組 SW480細(xì)胞的凋亡率為（26.330±2.863）% ，高 于si-NC組 的（7.215±0.765）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.17，P＜0.05）；si-XIST+anti-miRNA-34a組SW480細(xì)胞的凋亡率為（14.244±1.467）%，低于si-XIST+anti-miRNA-NC組的（24.132±2.363）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.158，P＜0.05）。

3 討論

隨著中國(guó)物質(zhì)生活水平的提高以及生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率顯著增加，且患者的病死率較高。有研究者從基因靶向治療探索結(jié)直腸癌放療抵抗的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的過程中伴隨lncRNA表達(dá)的變化[2-4]。lncRNA是一種不編碼蛋白的RNA分子，其表達(dá)量具有時(shí)間、空間以及組織特異性，在多種疾病中的表達(dá)量異常。近年來的研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等過程[5-8]。XIST是雌性哺乳動(dòng)物X染色體轉(zhuǎn)錄沉默過程中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在X染色體失活過程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，XIST與腫瘤的形成、發(fā)展密切相關(guān)，降低XIST的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌基因的作用[9-10]。在胃癌組織中，XIST表達(dá)量上調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)[11-12]。在鼻咽癌中，XIST的表達(dá)量顯著上調(diào)，與細(xì)胞的增殖、放療敏感性密切相關(guān)[13]。然而，XIST與結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性關(guān)系的研究較少。本研究應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)XIST基因在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織以及結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示XIST的表達(dá)量在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中均呈現(xiàn)上調(diào)，在SW480細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)尤其明顯，提示XIST與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究利用RNA干擾技術(shù)使SW480細(xì)胞中的XIST基因沉默，XIST沉默后增強(qiáng)了SW480細(xì)胞的放療敏感性，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

表5 各組SW480細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（%）

miRNA是一類調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的非編碼單鏈小RNA，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤的形成等過程[14-17]。越來越多的研究表明，miRNA參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在腫瘤預(yù)防和診斷中的作用日益被關(guān)注。研究表明，miRNA與腫瘤細(xì)胞的放療敏感性有關(guān)[18-20]。miRNA-34a一種腫瘤抑制因子，其表達(dá)量與腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切。研究顯示，miRNA-34a可通過作用于下游靶基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[21]。在裸鼠人肺癌移植瘤中，miRNA-34a可通過調(diào)節(jié)下游靶基因RAD51的表達(dá)，增加移植瘤的放射敏感性[22]。然而，miRNA-34a的表達(dá)是否對(duì)結(jié)直腸癌的放療敏感性具有影響以及miRNA-34a在結(jié)直腸癌中的作用是否與XIST具有相關(guān)性仍不確定。本研究的qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-34a在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）中低表達(dá)，在SW480細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)較明顯。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miRNA-34a可能是XIST的下游靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物時(shí)，XIST-WT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性明顯受到抑制；當(dāng)共轉(zhuǎn)染miRNA-34a抑制劑時(shí)，XIST-WT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性增加。無論是共轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物還是miRNA-34a抑制劑，XIST-MUT 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性均無顯著變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA-34a與XIST的靶向調(diào)控作用。本研究采用qPCR檢測(cè)XIST與miRNA-34a的靶向調(diào)控作用，結(jié)果顯示，上調(diào)XIST的表達(dá)可抑制miRNA-34a的表達(dá)量，下調(diào)XIST的表達(dá)作用正好相反，表明XIST在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中可負(fù)向調(diào)控miRNA-34a的表達(dá)量；抑制miRNA-34a的表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)下調(diào)XIST對(duì)SW480細(xì)胞放療敏感性的影響，表明XIST通過靶向調(diào)節(jié)miRNA-34a，調(diào)控結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的放療敏感性。

綜上所述，XIST在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)量增加，下調(diào)XIST的表達(dá)可增加結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的放療敏感性，抑制miRNA-34a的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)該作用。