白曉斌 霍龍偉 謝萬(wàn)福 徐高峰 王茂德

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma，GBM)是一種惡性原發(fā)性腦腫瘤，早期接受手術(shù)聯(lián)合規(guī)范放、化療的情況下仍會(huì)在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)腫瘤往往惡性程度更高且再次放化療效果甚微，中位生存期僅為12～15個(gè)月[1-2]。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(Checkpoint)是一類(lèi)細(xì)胞周期中保證染色體分配質(zhì)量和DNA正確復(fù)制的負(fù)反饋檢查機(jī)制[3]。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(Checkpoint kinase 1，Chk1)是一類(lèi)協(xié)調(diào)DNA合成以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期正常進(jìn)程的重要效應(yīng)分子[4]，研究證實(shí)Chk1過(guò)量表達(dá)與肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)以及治療耐受高度相關(guān)[4-9]，但是其在GBM中的表達(dá)及其與生物學(xué)行為和預(yù)后生存相關(guān)性尚不明確。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；聚丙烯酰胺凝膠購(gòu)自L(fǎng)ife Technology公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗、Tris-MOPS SDS電泳緩沖液和Western blot轉(zhuǎn)膜所用的Transfer Buffer購(gòu)自Thermo Fisher公司；抗Chk1抗體購(gòu)自L(fǎng)ifeSpan公司；抗β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；siCHEK1慢病毒購(gòu)自ABM公司。

1.2 資料收集整理

蛋白激酶基因差異表達(dá)結(jié)果通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)利用Bioconductor/TCGA biolink下載，利用Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.betastasis.com/glioma/rembrandt/)分析驗(yàn)證GBM和正常腦組織以及其它類(lèi)型膠質(zhì)瘤中蛋白激酶Chk1基因表達(dá)差異，并通過(guò)Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)利用Kaplan-Meier生存分析研究高低表達(dá)Chk1與臨床預(yù)后的關(guān)系。

研究同時(shí)納入西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科40例經(jīng)過(guò)手術(shù)病理切除GBM患者，男性24例，女性16例；年齡24～71歲，平均(58.62±8.25)歲；病變部位包括丘腦、島葉、頂葉、顳葉和額葉；GBM患者存在不同程度頭痛、惡心、肢體活動(dòng)和言語(yǔ)障礙。GBM患者信息獲取以及發(fā)表經(jīng)過(guò)患者本人或家屬同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

GBM細(xì)胞系(U87，U251，SHG-44)購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司，GBM細(xì)胞使用含有10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基至多每7～10天更換一次，加入Accutase酶在37℃，5% CO2條件下消化5 min至細(xì)胞脫壁后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入等體積培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，800 rpm離心5 min，棄上清后加入5 mL PBS洗去殘余培養(yǎng)基，再行800 rpm離心5 min，注入5 mL新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基重懸，采用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

GBM細(xì)胞系U87細(xì)胞傳代至第三代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞(1×104個(gè)/ mL )接種至96孔板內(nèi)，每孔接種1 mL，加入20 μL細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑(Alarma blue)，一次測(cè)量6個(gè)復(fù)孔，輕輕晃動(dòng)搖勻之后在37℃，5% CO2條件下孵育8 h，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)量在530 nm和590 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)應(yīng)分別在接種后0 d、2 d、4 d、6 d和8 d分別進(jìn)行，根據(jù)檢測(cè)所得結(jié)果繪制細(xì)胞體外增殖曲線(xiàn)。

1.5 Western blot檢測(cè)

分別收集GBM細(xì)胞系(U87，U251，SHG-44)和正常人星型膠質(zhì)細(xì)胞系(NHA)，在4℃條件下，經(jīng)過(guò)RIPA蛋白裂解液裂解30 min后，收集總蛋白，經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量后。利用分離膠(8%)以及濃縮膠(5%)對(duì)30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)模和蛋白封閉后，在4℃下孵育抗β-actin抗體過(guò)夜，洗膜處理后進(jìn)行二抗孵育，接著進(jìn)行顯影和成像，利用Image J軟件后進(jìn)行蛋白分析。

1.6 體外細(xì)胞成球試驗(yàn)

GBM細(xì)胞系U87細(xì)胞傳代至第三代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將單細(xì)胞懸液稀釋至1×102個(gè)/mL細(xì)胞濃度，依次按照0、1、10、20、40、50細(xì)胞/孔接種至96孔板內(nèi)，每個(gè)濃度設(shè)置10個(gè)復(fù)孔輕晃混勻后在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。統(tǒng)計(jì)各濃度復(fù)孔中無(wú)細(xì)胞球形成的孔數(shù)并計(jì)算其比率，利用Prism 6.0進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

1.7 實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)

Real-time PCR的詳細(xì)步驟參考已發(fā)表的相關(guān)論文[10]。GAPDH作為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)所用的引物序列如下：Chk1-Forward：ATATGAAGCGTGCCGTAGACT，Chk1-Reverse：TGCCTATGTCTGGCTCTATTCTG，GAPDH-Forward：GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA，GAPDH-Reverse：TTGAGGTCAATGAAGGGGTC。

1.8 免疫組化染色

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)采用辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)Chk1，詳細(xì)步驟參考已發(fā)表的相關(guān)論文[10]。染色結(jié)果由2名以上的研究員分別進(jìn)行觀(guān)察統(tǒng)計(jì)，染色結(jié)果按照德國(guó)免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(German immunohistochemical score，GIS)進(jìn)行評(píng)估。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)分：0分(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞)，1分(陽(yáng)性細(xì)胞比率<10%)，2分(11%<陽(yáng)性細(xì)胞比率<50%)，3分(51%<陽(yáng)性細(xì)胞比率<80%)，4分(陽(yáng)性細(xì)胞比率>80%)；染色強(qiáng)度評(píng)分：0分(無(wú)染色)，1分(弱染色)，2分(中度染色)，3分(強(qiáng)染色)；GIS評(píng)分結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。目的蛋白表達(dá)量的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：GIS評(píng)分<5分：低表達(dá)；5分≤GIS評(píng)分≤8分：中度表達(dá)；GIS評(píng)分>8分：高表達(dá)。

1.9 慢病毒轉(zhuǎn)染

GBM細(xì)胞系U87細(xì)胞傳代至第三代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并4×105個(gè)/mL接種1 mL至預(yù)先用層粘連蛋白處理過(guò)的無(wú)菌六孔板中，37℃，5% CO2條件下孵育6 h待細(xì)胞完全貼壁；將購(gòu)得的siChk1慢病毒在冰上溶化后，在3 mL培養(yǎng)基中加入3 μL聚凝胺和20 μL慢病毒，混合充分后加入6孔板中；轉(zhuǎn)染12 h后在熒光顯微鏡下觀(guān)察GFP表達(dá)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，如轉(zhuǎn)染效率滿(mǎn)意，移除含有慢病毒的培養(yǎng)基后注入3 mL Accutase消化液消化細(xì)胞后，加入3 mL培養(yǎng)基終止反應(yīng)，室溫下800 r/min離心5 min；移除上清液后加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，輕柔吹打后將細(xì)胞懸液接種至無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染通過(guò)Real-time PCR及Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Chk1在GBM組織和細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中668個(gè)蛋白激酶編碼基因的表達(dá)進(jìn)行分析[11]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同正常腦組織相比，Chk1是在GBM中表達(dá)上調(diào)最為顯著的蛋白激酶編碼基因之一(圖1)。同時(shí)，對(duì)Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示Chk1在GBM中的表達(dá)顯著高于正常腦組織及其他類(lèi)型膠質(zhì)瘤(圖2)。為了進(jìn)一步研究Chk1在GBM細(xì)胞中的表達(dá)情況，本研究利用Realtime PCR和Western blot對(duì)3株GBM細(xì)胞系(U87，U251，SHG-44)和1株正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(NHA)中Chk1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示GBM細(xì)胞中Chk1的mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)(圖3，圖4)。

圖2 Chk1在GBM組織中的表達(dá)高于正常腦組織及其他類(lèi)型膠質(zhì)瘤組織Figure 2 Chk1 gene was highly expressed in GBM in comparison with normal brain tissues and other subtypes of glioma cells.Note：** P<0.01，*** P<0.001，ns P>0.05.

圖1 Chk1在GBM組織中高表達(dá)Figure 1 Chk1 gen was highly expressed in GBM tissues

圖3 Real-time PCR結(jié)果顯示Chk1在GBM細(xì)胞(U87，U251，SHG-44)中高表達(dá)Figure 3 Chk1 at mRNA level was highly expressed in GBM U87，U251 and SHG-44 cellsNote：** P<0.01，*** P<0.001.

圖4 Western blot結(jié)果顯示Chk1在GBM細(xì)胞(U87，U251，SHG-44)中高表達(dá)Figure 4 Chk1 protein was highly expressed in GBM U87，U251 and SHG-44 cells

圖5 Real-time PCR結(jié)果顯示siChk1轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞中Chk1表達(dá)下調(diào)Figure 5 Real-time PCR analysis indicated Chk1 was decreased after siChk1 transfection in U87 cellsNote：**P<0.01.

圖6 Western blot結(jié)果顯示siChk1轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞中Chk1表達(dá)下調(diào)Figure 6 Western blot analysis indicated Chk1 was decreased after siChk1 transfection in U87 cells

2.2 Chk1能夠促進(jìn)GBM細(xì)胞的體外增殖和成球能力

為了進(jìn)一步說(shuō)明Chk1對(duì)GBM細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)特異性沉默GBM細(xì)胞中Chk1表達(dá)，Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示：沉默后GBM細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，Chk1表達(dá)顯著下降(圖5，圖6)。同對(duì)照組相比，沉默Chk1表達(dá)后GBM細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)和體外成球能力(P<0.05)顯著受到抑制，表明Chk1對(duì)GBM細(xì)胞的增殖和成球能力具有促進(jìn)作用(圖7，圖8)。

圖7 體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示siChk1 U87細(xì)胞的增殖能力顯著受到抑制Figure 7 Chk1 knock-down reduced cell proliferation of U87 cellsNote：**P<0.01，compared with the control.

圖8 體外成球?qū)嶒?yàn)顯示siChk1 U87細(xì)胞的成球能力顯著受到抑制Figure 8 Chk1 knock-down reduced colony-formation in U87 cellsNote：*P<0.05，compared with the control.

2.3 Chk1高表達(dá)與GBM患者不良預(yù)后相關(guān)

收集自2010—2016年期間就診于我院的GBM患者病理組織切片共40例，利用免疫組化染色對(duì)Chk1的表達(dá)進(jìn)行分析(圖9)，并對(duì)Chk1的表達(dá)和患者預(yù)后生存相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明Chk1低表達(dá)組GBM患者的臨床預(yù)后顯著優(yōu)于高表達(dá)組患者(圖10)。與此相似，對(duì)Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)中537例GBM患者的預(yù)后和Chk1表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Chk1高表達(dá)同GBM患者的不良預(yù)后高度相關(guān)(圖11)，提示Chk1可能作為預(yù)測(cè)GBM患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

圖9 利用免疫組化染色分析GBM腫瘤中Chk1的表達(dá)Figure 9 The expression of Chk1 protein in GBM tissues by immunohistochemistry

圖10 Chk1高表達(dá)同GBM患者的不良預(yù)后高度相關(guān)Figure 10 The expression of Chk1 was correlated to poor prognosis in GBM patients

圖11 Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示Chk1高表達(dá)同GBM患者的不良預(yù)后高度相關(guān)Figure 11 The expression of Chk1 was correlated to poor prognosis in GBM patients from Rembrandt database

3 討論

GBM是一類(lèi)復(fù)發(fā)率高和預(yù)后較差的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其5年生存率低于5%[12-13]。蛋白激酶因其參與細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控以及基因修復(fù)等重要生命活動(dòng)而得到廣泛關(guān)注[14]。Chk1是一種含有200個(gè)氨基酸的復(fù)合物，通過(guò)磷酸化活化激活A(yù)TM/R激酶[15]。Chk1同多種腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)有關(guān)，其重要生物學(xué)功能之一是通過(guò)誘導(dǎo)DNA修復(fù)進(jìn)而使細(xì)胞獲得對(duì)放療及某些化療藥物的耐受性[8]。Matsumoto等[16]通過(guò)臨床研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)嘧啶類(lèi)似物吉西他濱能夠激活原發(fā)性肝癌和膽管癌中Chk1活性并且能激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2，增加腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)并減少其凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)其對(duì)吉西他濱的耐受性。另有研究通過(guò)免疫組化測(cè)定Chk1在子宮頸癌和慢性子宮頸炎患者中的陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)子宮頸癌的陽(yáng)性表達(dá)顯著上升[5，9]。除此之外，在生殖系統(tǒng)腫瘤包括女性卵巢癌和男性前列腺癌中，Chk1信號(hào)分子被激活，表達(dá)顯著增高，參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[17]。雖然Chk1被證實(shí)同多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)并通過(guò)多種分子生物學(xué)機(jī)制參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但是Chk1在膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用仍不明確。本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(kù)(Rembrandt)選擇和分析GBM中Chk1的表達(dá)并采用Western blot和Real-time PCR等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)GBM細(xì)胞中Chk1的表達(dá)水平，同時(shí)利用慢病毒轉(zhuǎn)染siRNA沉默Chk1的表達(dá)以探究其對(duì)于GBM細(xì)胞增殖能力的作用；同時(shí)利用免疫組化染色及Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Chk1同GBM患者的預(yù)后生存進(jìn)行分析，結(jié)果表明Chk1在GBM中高表達(dá)，而特異性沉默Chk1能夠顯著抑制GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)和成球能力；同時(shí)，Chk1低表達(dá)組GBM患者的臨床預(yù)后顯著優(yōu)于高表達(dá)組患者，證實(shí)了Chk1表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并和GBM患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示Chk1可能作為GBM臨床治療和藥物研發(fā)新的潛在靶點(diǎn)，為GBM治療提供了新想法。

Chk1促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制主要是調(diào)控ATR-Chk1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而啟動(dòng)細(xì)胞損傷修復(fù)程序，能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞化學(xué)治療的耐受性[18]。Lam等[19]通過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)指明Chk1在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和維持細(xì)胞周期和基因信息穩(wěn)定性方面具有重要意義。Kohn等[20]通過(guò)反復(fù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Chk1在p53突變的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用，Chk1抑制劑UCN-01能夠恢復(fù)細(xì)胞周期異常。盡管我們的研究發(fā)現(xiàn)Chk1對(duì)于GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)具有重要的調(diào)控作用，但其分子生物學(xué)機(jī)制尤其是下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍需進(jìn)一步深入的研究。值得注意的是，Levesque等[21]證實(shí)Chk1不僅在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且抑制Chk1能夠影響正常細(xì)胞的生物學(xué)行為，因此抗Chk1靶點(diǎn)藥物抗腫瘤效果還存在一定爭(zhēng)議。因此，Chk1表達(dá)與GBM生物學(xué)行為和臨床預(yù)后相關(guān)性尚需要進(jìn)一步的探索和研究。