朱歡葉 簡月奎 李 波 高 淦 田 震 舒 嫚

凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin-1，TSP-1)是一個多功能細胞基質(zhì)糖蛋白，參與許多生物學過程，比如血小板聚集、調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞黏附、腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成[1-2]。在乳腺癌細胞中，TSP-1能夠抑制細胞增殖和侵襲[3]。在肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中，TSP-1蛋白的表達和惡性腫瘤發(fā)展之間呈顯著負相關(guān)[4]。有研究證明TSP-1能夠促進骨肉瘤細胞U2OS和SAOS的黏附[5]。另外亦有相關(guān)研究[6-7]發(fā)現(xiàn)TSP-1基因敲除后骨肉瘤細胞的增殖、遷移侵襲能力明顯降低，并且進一步證明內(nèi)源性TSP-1可以抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的血管生成，提示TSP-1基因能夠影響骨肉瘤的血管生成。目前關(guān)于TSP-1對腫瘤的影響多數(shù)集中在乳腺癌、胃癌、肺癌等，對于骨肉瘤方面的研究甚少，其作用機制目前也尚不明確。本文通過TSP-1基因過表達和沉默的方式探索TSP-1對人骨肉瘤細胞MG-63功能的影響，以期為研究骨肉瘤的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 所用細胞系

人骨肉瘤細胞系MG-63購于上海中科院細胞庫。實驗前從液氮中取出凍存的細胞迅速放入37℃恒溫水浴鍋中解凍，期間不斷搖動加速解凍。在超凈工作臺中迅速將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10 mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中混勻。用移液器將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶上標明細胞的代數(shù)及日期，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 TSP-1過表達載體和干擾載體的構(gòu)建 將TSP-1基因cds區(qū)片段克隆至PUC57載體構(gòu)建過表達載體pBPLV-TSP-1。構(gòu)建3條TSP-1基因干擾載體，干擾載體序列如表1所示。然后將干擾載體轉(zhuǎn)染到MG-63細胞中，96 h后提取細胞RNA進行qPCR驗證，篩選出效率最高的一條載體(pBPLV-shRNA-TSP-1 vector)進行后續(xù)實驗。

表1 TSP-1干擾載體基因序列Table 1 Gene sequence of TSP-1 interference vector

1.2.2 實驗分組 實驗分為5組：MG-63細胞正常培養(yǎng)組(Control)；MG-63細胞+TSP-1表達空載體組(pBPLV-TSP-1 vector)；MG-63細胞+TSP-1干擾空載體組(pBPLV-shRNA-TSP-1 vector)；MG-63細胞+pBPLV-TSP-1組(pBPLV-TSP-1)；MG-63細胞+pBPLV-shRNA-TSP-1組(pBPLV-shRNA-TSP-1)。

1.2.3 CCK-8檢測 取生長狀態(tài)良好的MG-63細胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化3 min，加入含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基，將細胞吹打下來并吸取到10 mL離心管中，離心，棄上清，加入培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種到96孔板中。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。約24 h后細胞長到每孔約為70%～80%時給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入CCK-8試劑，并后續(xù)測定吸光度值，計算各組細胞活力。

1.2.4 Transwell實驗 將轉(zhuǎn)染后的各組細胞種板前1天，血清饑餓12 h，常規(guī)消化、離心收集細胞，用低血清1640培養(yǎng)液(含0.2%FBS)混懸成單細胞懸液。將Transwell培養(yǎng)池放入24孔培養(yǎng)板中，上室內(nèi)加入100 μL細胞懸液，下室內(nèi)加入500 μL含10% FBS的1640培養(yǎng)液。將24孔板置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出侵襲小室將其中的培養(yǎng)基去掉，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min后棄去固定液，加入適量PBS洗滌細胞，再加入Giemsa染色劑室溫染色15 min后，取出小室，用棉簽將小室內(nèi)細胞擦去，顯微鏡拍照。

1.2.5 免疫熒光 將玻片置于細胞培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，爬完后用4%的多聚甲醛進行細胞固定，然后用0.5%Triton X-100室溫通透20 min，再在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，封閉完成后，加入一抗THBS1(1∶500)，p38 MAPK(1∶500)，CD36(1∶500)進行免疫反應(yīng)，并放入濕盒，4℃孵育過夜。一抗孵育后加入熒光二抗Cy3(1∶200)放入濕盒中20～37℃孵育1 h，再滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，然后封片，最后進行圖像采集。

1.2.6 qPCR檢測 取細胞進行RNA的提取，提取RNA后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR進行檢測各組細胞中的TSP-1、CD36、p38MAPK、VEGF、VEGFR-1、EGF和PDGF等基因表達量。

1.2.7 Western blot檢測 采用Western blot技術(shù)檢測基因干擾后TSP-1蛋白表達以及血管生成相關(guān)因子CD36、EGF、P38、PDGF、VEGF、VEGFR-1的表達。將細胞進行收集并離心，加入相應(yīng)的裂解液，4℃裂解30 min，在10 000 rpm離心10 min，小心吸取上清，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜50～90 min。4℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PCR驗證TSP-1過表達載體和干擾載體的構(gòu)建情況

用引物plvxpuro-F/plvxpuro-R進行PCR擴增質(zhì)粒plvxpuro，理論上應(yīng)有254 bp的條帶，而TSP-1基因片段大小為3 525 bp，即TSP-1-plvxpuro經(jīng)菌落PCR后，理論上會得到3 779 bp大小的條帶，菌落PCR電泳結(jié)果如圖1所示，電泳結(jié)果與理論值相符，有陽性點。

2.2 qPCR驗證載體轉(zhuǎn)染效率

與對照組相比，轉(zhuǎn)染過表達空載體和干擾空載體之后細胞中TSP-1的表達量均沒有明顯變化(P=0.073，P=0.086)；與相應(yīng)的空載體組相比，轉(zhuǎn)染表達載體后，細胞中TSP-1的表達量明顯升高(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染三條不同干擾載體后，其中一條干擾載體組表達量相較于空載體組明顯下降(P<0.01)，其余2條干擾載體組均無統(tǒng)計學差異(P=0.078，P=0.083)(圖2)。

圖1 菌落PCR電泳驗證載體構(gòu)建Figure 1 Identification of colony PCR electrophoresisto vector constructionNote：M.DL15000 maker；1.Plvxpuroplasmid；2-10.TSP-1-plvxpuro.

圖2 qPCR驗證載體的轉(zhuǎn)染效率Figure 2 The transfection efficiency of the vector was verified by qPCRNote：*P<0.05，when compared with the control.

圖3 CCK-8檢測TSP-1基因?qū)毎盍Φ挠绊慒igure 3 Effect of TSP-1 geneon cell viability by CCK-8Note：* P<0.05，when compared with the corresponding emptyvector.

2.3 CCK-8檢測TSP-1基因?qū)毎盍Φ挠绊?/h3>

與對照組相比，轉(zhuǎn)染過表達空載體和干擾空載體之后細胞活力均沒有明顯變化(P=0.075，P=0.081)；與相應(yīng)的空載體組相比，轉(zhuǎn)染過表達載體后細胞活力明顯升高(P=0.023)，轉(zhuǎn)染干擾載體后細胞活力明顯降低(P=0.027)(圖3)。表明TSP-1能夠促進MG-63的增殖，提高細胞活力。

2.4 Transwell實驗檢測TSP-1對MG-63細胞侵襲能力的影響

與對照組相比，表達空載體組與干擾空載體組對細胞侵襲能力無明顯差異；與表達空載體組相比，表達載體組細胞侵襲的數(shù)目明顯增多(P=0.011)；而干擾載體組細胞數(shù)目相對于干擾空載體組明顯減少(P=0.014)(圖4)。

2.5 免疫熒光檢測各實驗組中CD36、P38、TSP-1蛋白表達情況

相較于對照組、表達空載體組、干擾空載體組，干擾載體組中的CD36(P=0.026，P=0.015，P=0.021)、P38(P=0.018，P=0.011，P=0.016)和TSP-1(P=0.019，P=0.024，P=0.031)表達量明顯減少，而表達載體組中的CD36(P=0.036，P=0.024，P=0.028)、P38(P=0.033，P=0.029，P=0.017)和TSP-1(P=0.030，P=0.022，P=0.016)表達量則明顯升高，說明TSP-1過表達能促進CD36、P38、TSP-1的表達，干擾載體pBPLV-shRNA-TSP-1能很好的抑制CD36、P38、TSP-1的表達(圖5)。

圖4 Transwell實驗檢測TSP-1對MG-63細胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of TSP-1 on invasion of MG-63 cells by Transwell experimentNote：* P<0.05，when compared with the corresponding empty vector and control.

圖5 免疫熒光檢測TSP-1基因?qū)D36、P38、TSP-1蛋白表達的影響Figure 5 The effect of TSP-1 gene on the expression of CD36，P38 and TSP-1 protein by immunofluorescence assayNote：The red fluorescence represents the expression of CD36，P38，TSP-1，and the blue fluorescence represents the nucleus.

2.6 qPCR檢測TSP-1對相關(guān)基因表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示相對于對照組、表達空載體組，表達載體組的CD36、EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1表達量顯著上升(P<0.01)，干擾載體組的作用正好相反，成功抑制了相關(guān)基因的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖6)。

圖6 qPCR檢測TSP-1對相關(guān)基因表達的影響Figure 6 The effect of TSP-1 on gene expression was detected by qPCRNote：* P<0.05，compared with control；# P<0.05，compared with empty expression vector；Δ P<0.05，compared with empty interference vector；^P<0.05，compared with expression vector.

2.7 Western Blot檢測TSP-1基因?qū)ο嚓P(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示了相對于對照組、表達空載體組，表達載體組的CD36、EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1表達量顯著上升(P<0.01)，干擾載體組的作用正好相反，成功的抑制了CD36、EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1的表達，顯示了良好的作用，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖7)，與qRT-PCR結(jié)果一致。

圖7 Western Blot檢測TSP-1基因?qū)ο嚓P(guān)蛋白表達的影響Figure 7 The effect of TSP-1 on the expression of related proteins by Western blotNote：*P<0.05，compared with control；#P<0.05，compared with empty expression vector；ΔP<0.05，compared with empty interference vector；^P<0.05，compared with expression vector.

3 討論

本研究結(jié)果表明TSP-1能夠促進MG-63細胞的增殖和侵襲，促進血管形成相關(guān)蛋白的表達影響骨肉瘤的血管形成，這個作用與P38-MAPK信號通路有關(guān)。

血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，是腫瘤細胞迅速增殖的前提條件，因此抗腫瘤血管生成治療一直是腫瘤治療的重要靶點，研究新型血管生成抑制劑對于腫瘤的治療具有重大的意義[5]。大量的研究表明TSP家族中的TSP-1和TSP-2具有抗腫瘤血管生成作用，認為TSP-1是非常重要的血管生成抑制因子，能夠抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[7-9]。Lawler等的研究發(fā)現(xiàn)在p53缺失小鼠模型中，TSP-1缺失后小鼠患骨肉瘤的概率明顯大于TSP-1過表達的小鼠[10]。與許多研究的結(jié)論不一致的地方在于本研究結(jié)果證明TSP-1能夠促進MG-63細胞的增殖和侵襲能力?？赡艿脑蛟谟陬愋筒煌琓SP-1在不同的腫瘤細胞中發(fā)揮不同的調(diào)控功能，許多在腦腫瘤、甲狀腺瘤、黑色素瘤和前列腺瘤的研究發(fā)現(xiàn)TSP-1能夠促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移能力[11-14]。Chuanzhen等的研究也發(fā)現(xiàn)TSP-1能夠通過FAK信號通路促進骨肉瘤U2OS和Well5細胞的增殖和侵襲[6]。這一結(jié)論與本研究結(jié)果是相一致的，本研究通過CCK-8和Transwell實驗證明過表達TSP-1后MG-63細胞的增殖能力和侵襲能力均有明顯升高，而通過shRNA干擾TSP-1的表達后細胞的增殖能力和侵襲能力明顯下降。

為了探究TSP-1是調(diào)控MG-63細胞功能的可能機制，本研究采用了免疫熒光技術(shù)檢測TSP-1基因過表達和干擾之后P38、TSP-1、CD36蛋白水平的表達變化。免疫熒光結(jié)果顯示，過表達TSP-1后，TSP-1、P38、CD36的表達均有明顯升高，而干擾TSP-1的表達之后TSP-1、P38、CD36表達明顯下降，這個結(jié)果提示TSP-1調(diào)控MG-63細胞增殖和侵襲可能與P38 MAPK通路及腫瘤血管生成有關(guān)。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)多種骨肉瘤血管生成相關(guān)的因子和患者的預(yù)后密切相關(guān)[15]。細胞因子FGF-2、VEGF、EGF、TGF-β都具有調(diào)節(jié)TSP-1表達的作用[13，16]。VEGF是作用最強的血管內(nèi)皮生長因子之一，VEGF與其受體VEGFR結(jié)合后特異性地刺激血管內(nèi)皮細胞有絲分裂，促進血管新生，同時VEGF作為一個強有力的腫瘤淋巴管生成因子促進淋巴系統(tǒng)腫瘤擴散，在腫瘤組織中的表達變化與腫瘤的血管化程度以及浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學行為之間存在著密切的聯(lián)系[17]。PDGF是一種受體酪氨酸激酶，在細胞的生長、增殖和分化中起重要的作用，PDGF通過與受體結(jié)合促進血管內(nèi)皮細胞增殖分化，促進腫瘤的血管生成，從而促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。

因此本研究進一步使用qPCR、Western blot技術(shù)檢測了TSP-1干擾和過表達之后EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1在蛋白和mRNA水平的變化情況。結(jié)果表明TSP-1基因干擾和過表達后MG-63細胞中VEGF、VEGFR、PDGF的mRNA水平和蛋白表達水平均有顯著升高。在一些腫瘤細胞中，TGF-β和TSP-1之間存在一種正反饋調(diào)節(jié)，TSP-1的表達能夠促進細胞因子TGF-β的表達，TGF-β的表達又能進一步促進TSP-1的表達[19-20]。這個結(jié)果提示TSP-1可能通過正反饋調(diào)節(jié)促進VEGF、VEGFR、PDGF的表達，從而促進骨肉瘤的血管形成。與Uchida的研究相一致，其研究發(fā)現(xiàn)在MG-63細胞中TGF-β能夠促進TSP-1的表達[21]。Chen的研究也證明TGF-β能夠誘導TSP-1的mRNA表達，這個作用是通過P38-MAPK信號通路介導的[22]。我們的實驗中免疫熒光結(jié)果結(jié)合WB和qPCR結(jié)果表明TSP-1表達的上調(diào)會促進P38 MAPK蛋白及mRNA的表達。Yee等的研究證明TSP-1敲除會導致原發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)展，但是抑制轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展[23]。也有研究證明TSP-1的表達可以促進腫瘤血管生成，是胃癌生存的良好預(yù)后因子[24-25]。所以我們有理由相信在MG-63細胞中，TSP-1可以通過正反饋促進細胞因子VEGF、VEGFR、PDGF的表達，從而激活p38 MAPK通路促進細胞增殖和侵襲能力及腫瘤血管生成。關(guān)于TSP-1基因的研究結(jié)果顯示出了TSP-1基因與腫瘤關(guān)系的兩面性，在不同的腫瘤中，TSP-1的表達對腫瘤血管生成具有不同的作用，其在每一種腫瘤中的作用機制仍需要更多的研究來闡明。

綜上所述，TSP-1能夠促進MG-63細胞生長因子VEGF、VEGFR、PDGF的表達，上調(diào)P38-MAPK通路，進而促進細胞的增殖和侵襲，影響骨肉瘤血管形成。