唐艷麗 李萬樂 熊升華 等

[摘要] 目的 探討毛細支氣管炎患兒外周血CD4+CD25+ Treg細胞及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-4、8、10水平變化及臨床意義。 方法 選取2016年6月～2017年6月于本院兒科治療的毛細支氣管炎患兒80例，初次發(fā)作喘息患兒為輕癥組（A組），合并呼吸衰竭或心力衰竭患兒為重癥組（B組），另選取同時期健康體檢者40例為正常對照組（C組），應(yīng)用流式細胞術(shù)測定外周血CD4+CD25+ Treg細胞比例，ELISA法檢測血清TNF-α、IL-8、IL-4和IL-10表達水平，比較各組不同指標間的差異。 結(jié)果 治療前，毛細支氣管炎患兒CD4+CD25+ Treg細胞比例明顯低于正常對照組（P<0.05）;血清TNF-α、IL-8水平明顯高于對照組（P<0.05），血清IL-4、IL-10水平明顯低于對照組（P<0.05）;治療1周后，Treg細胞呈現(xiàn)增高趨勢，A組Treg細胞比例明顯高于B組（P<0.05）;血清TNF-α、IL-8水平較前明顯下降，IL-4、IL-10水平較前明顯上升（P<0.05）。 結(jié)論 毛細支氣管炎患兒病情嚴重程度與Th1/Th2平衡的紊亂程度具有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 毛細支氣管炎;嬰幼兒;調(diào)節(jié)性T細胞;細胞因子

[中圖分類號] R725.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）05-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of peripheral blood CD4+CD25+ Treg cells and tumor necrosis α （TNF-α）， interleukin（IL）-4， 8， 10 in children with bronchiolitis and their clinical significance. Methods A total of 80 children with bronchiolitis who treated in the Department of Pediatrics in our hospital from June 2016 to June 2017 were enrolled. The children with initial onset of wheezing were set as mild group（group A）. The patients combined with respiratory failure or heart failure were set as the severe group（group B）. Another 40 healthy controls were selected as the normal control group （group C） in the same period. The percentage of CD4+CD25+ Treg cells in peripheral blood was determined by flow cytometry. The expressions of serum TNF-α， IL-8， IL-4 and IL-10 were detected by ELISA. Different indicators of each group were compared. Results Before treatment， the proportion of CD4+CD25+ Treg cells in children with bronchiolitis was significantly lower than that in the normal control group（P<0.05）. The levels of serum TNF-α and IL-8 in children with bronchiolitis were significantly higher than those in the control group（P<0.05）. The levels of IL-4 and IL-10 in children with bronchiolitis were significantly lower than those of the control group（P<0.05）. After 1 week of treatment， Treg cells showed an increasing trend. The proportion of Treg cells in group A was significantly higher than that in group B（P<0.05）. The levels of serum TNF-α and IL-8 were significantly lower than those before， and the levels of IL-4 and IL-10 were significantly higher than those before（P<0.05）. Conclusion The severity of children with bronchiolitis is correlated with the disorder degree of Th1/Th2 balance.

[Key words] Bronchiolitis; Infants; Regulatory T cells; Cytokines

毛細支氣管炎（bronchiolitis）是嬰幼兒期常見的呼吸道疾病，好發(fā)于2歲以內(nèi)，如不及時干預，遠期預后不佳，部分患兒可發(fā)展為哮喘[1]。越來越多的研究顯示，毛細支氣管炎是感染性和變態(tài)反應(yīng)性炎癥交雜的臨床綜合征。Th1/Th2細胞比例在毛細支氣管炎患者存在失衡，促炎性細胞因子（如TNF-α、IL-8）表達增加，抑炎性細胞因子（如IL-4、IL-10）表達下降。已有研究證實，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25+ regulatory T cell，CD4+CD25+ Treg cell）參與了毛細支氣管炎的發(fā)病機制，因其具有免疫抑制功能，其數(shù)量低下和功能紊亂可導致免疫抑制功能的異常。毛細支氣管炎反復發(fā)作，易出現(xiàn)氣道重塑，部分可發(fā)展為哮喘，降低患兒生活質(zhì)量，目前尚缺乏明確有效的對因治療措施。與以往研究證實哮喘與毛細支氣管炎之間存在相似的免疫功能紊亂相符。因此，對其進行深入研究具有重要臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

所有入組患兒監(jiān)護人均知情同意，隨機選取2016年6月～2017年6月于本院兒科住院病房確診的毛細支氣管炎初次發(fā)作喘息的患兒為研究對象（A組），患兒年齡≥28 d，≤24月，排除支氣管異物、心源性哮喘、先天性喉喘鳴、嗜酸粒細胞性肺炎、胃食管反流等疾病引起的喘息。各組研究對象診斷標準均符合《實用兒科學》第7版。毛細支氣管炎合并呼吸衰竭或心力衰竭患兒為重癥患兒（B組），另隨機選取40例同期同年齡組健康體檢嬰幼兒作為正常對照組（C組）。對照組嬰幼兒均在2個月內(nèi)未患感染性疾病，既往無反復呼吸道感染病史，無過敏史，無先天性心臟病、寄生蟲，無腫瘤、自身免疫性疾病，未使用激素和免疫抑制劑。三組嬰幼兒年齡、性別及體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

分別采集A、B組患兒入院后第1天（發(fā)作期采血，且采血前未使用激素）及治療后7 d的靜脈血，C組患兒體檢時抗凝靜脈血6 mL，3 mL靜脈血以3000 r/min離心10 min，提取上清液，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫雙抗體夾心（ELISA）法測定各組兒童血清中TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10的水平;儀器為美國伯樂680酶聯(lián)儀，試劑盒均由廣州威佳科技有限公司提供，嚴格遵照試劑盒說明書進行相關(guān)操作，按照繪出的標準曲線得出TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10值。

另3 mL靜脈血在室溫24 h內(nèi)用于細胞分離，應(yīng)用Ficoll梯度離心法分離外周血單核淋巴細胞，然后用細胞培養(yǎng)液將細胞配成5×106/mL細胞懸液備用;按照熒光抗體試劑盒說明書，使用美國B-D公司FACSCalibur流式細胞儀測定Treg細胞水平。

1.3觀察指標

毛細支氣管炎患兒常規(guī)予以激素、霧化平喘、補液等對癥治療，連用1周。觀察并比較治療前和治療1周后外周血CD4+CD25+ Treg細胞水平及血清TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10水平變化。而健康對照組嬰幼兒僅在入組時測定1次。

1.4 統(tǒng)計學方法

對所有數(shù)據(jù)進行整理、匯總并應(yīng)用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較行t檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FCM檢測CD4+CD25+ Treg細胞結(jié)果

采集治療前后各組嬰幼兒外周血，按照流式細胞術(shù)操作流程，依次檢測各組外周血CD4+CD25+ Treg細胞水平（CD4+CD25+ Treg/CD4+ T%），見表2。A組為（3.29±0.41）%，B組為（2.14±0.12）%，C組為（3.52±0.31）%，B組明顯低于C組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），B組低于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療7 d后，A組為外周血CD4+CD25+ Treg細胞水平為（3.31±0.38）%，B組為（2.96±0.65）%，C組為（3.52±0.31）%，B組明顯低于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），A組與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 各組外周血Th1/Th2細胞因子檢測結(jié)果

2.2.1 ELISA法檢測各組嬰幼兒TNF-α、IL-4的結(jié)果? 在治療前后，對各組嬰幼兒血清TNF-α、IL-4水平進行檢測，結(jié)果見表3。治療前，B組TNF-α水平明顯高于C組及A組;B組IL-4水平明顯低于C組及A組;治療1周后，A組TNF-α水平明顯低于B組;A組IL-4水平高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2.2 各組嬰幼兒外周血IL-8、IL-10細胞因子檢測結(jié)果? 在治療前后，對各組嬰幼兒血清IL-8、IL-10進行檢測，結(jié)果見表4。治療前，B組IL-8水平明顯高于C組及A組;B組IL-10水平明顯低于C組及A組;在治療1周后，A組IL-8水平明顯低于B組;A組IL-10水平高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

毛細支氣管炎多見于2歲以下嬰幼兒，是一種急性感染性疾病;感染累及直徑75～300 μm的細支氣管，急性炎癥、黏膜水腫、上皮細胞壞死、黏液分泌增多致細支氣管狹窄與阻塞是該病的病理基礎(chǔ)。既往研究證實，25%～50%毛細支氣管炎患兒病愈后可出現(xiàn)癥狀復發(fā)，多表現(xiàn)反復喘息發(fā)作，其中30%最終可發(fā)展為哮喘，其具體發(fā)病機制目前尚不明確，其中免疫失衡可能在發(fā)病過程中扮演重要角色[2-4]。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在維持機體免疫平衡方面起著重要作用，具有免疫負向調(diào)節(jié)功能，能夠抑制效應(yīng)性T細胞的分化、增殖及其活性，其數(shù)量低下和功能紊亂可導致多種自身免疫性疾病的發(fā)生[5-7]。Zhu YF等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在患者的肺泡灌洗液中，因CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Treg細胞比值偏低，出現(xiàn)機體免疫抑制功能異常，從而導致了毛細支氣管炎的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前，B組患兒外周血Treg細胞水平較正常對照組明顯降低，統(tǒng)計學處理有顯著性差異（P<0.05），A組與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示毛細支氣管炎患兒外周血調(diào)節(jié)性T細胞水平紊亂，其數(shù)量越低，表明病情越嚴重，可能預后不佳。治療后，Treg細胞水平明顯上升，與A組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05），提示毛細支氣管炎患兒治療后，Treg細胞水平可一定程度恢復，與臨床癥狀緩解有直接關(guān)系。

既往研究[9]證實，毛細支氣管的發(fā)病與病毒感染密切相關(guān)，機體出現(xiàn)Th1/Th2免疫失衡，這種動態(tài)平衡一旦被打破，釋放大量炎性細胞因子，介導機體的免疫炎癥反應(yīng)，參與毛細支氣管炎的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。Mosmann TR等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Th1細胞主要分泌促炎性細胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-8;Th2細胞則主要分泌抑炎性細胞因子，如IL-4、IL-10，細胞因子本身是Th1/Th2分化的最有力的調(diào)節(jié)因素。近年來毛細支氣管炎嬰兒與動物模型的研究表明，喘息反復發(fā)作與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)。病毒感染時導致促炎性細胞因子（如TNF-α、IL-8）表達增加。TNF-α及IL-8作為炎癥介質(zhì)參與毛細支氣管炎的發(fā)病過程[11]。TNF-α是單核巨噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)生的具有腫瘤殺傷作用的細胞因子，并且對機體炎癥和免疫應(yīng)答有調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究也證實[12-14]，呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎患兒外周血檢測中不僅存在Th1/Th2和IFN-γ/IL-4的調(diào)節(jié)失衡，也存在TGF-β/IL-17和IL-10/IL-17失衡。

已有研究證實[15-16]，IL-4在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著非常關(guān)鍵的作用，不僅可促進B細胞增殖，并誘導分化為漿細胞，產(chǎn)生IgE，還可以通過促進血管內(nèi)皮因子的表達，使炎性細胞在炎癥局部浸潤增加。另有報道GSI可通過調(diào)節(jié)Notch相關(guān)基因的表達，誘導IL-4含量發(fā)生變化，引起哮喘患兒體內(nèi)Th2優(yōu)勢向Th1應(yīng)答轉(zhuǎn)變，從而減輕哮喘氣道炎癥[17]。IL-10是Th2細胞因子中重要的下調(diào)因子，對氣道炎癥具有抑制作用，可調(diào)節(jié)機體免疫功能。IL-10有減輕呼吸道炎癥的作用，這可能對哮喘和毛細支氣管炎的治療有潛在應(yīng)用價值。另有研究證實，IL-10水平上升也可以促進效應(yīng)性T細胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細胞。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C組比較，B組患兒急性期血清TNF-α、IL-8水平明顯增高，IL-4、IL-10水平明顯下降，A組細胞因子含量改變不明顯，差異無統(tǒng)計學意義，提示毛細支氣管炎急性期Th2類細胞因子受抑制，Th1細胞功能亢進，存在Th1/Th2功能失調(diào)，其程度與病情嚴重有直接關(guān)系。經(jīng)治療后，B組毛細支氣管炎患兒血清TNF-α、IL-8水平較前下降，與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義;IL-4、IL-10水平有所恢復，但仍低于C組。本研究結(jié)果也證實毛細支氣管炎病情嚴重程度與Th1/Th2平衡的紊亂程度呈正相關(guān)性。

綜上所述，毛細支氣管炎患兒的免疫功能可能受到損害，其損害程度與病情密切相關(guān)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例與疾病嚴重程度呈負相關(guān)趨勢，這提示臨床治療方面，可適當應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑，可能對提高療效、縮短病程及遠期預后有重要意義。調(diào)節(jié)性T細胞、TNF-α、IL-8、IL-4和IL-10水平異常與毛細支氣管炎患兒疾病進展相關(guān)，也可作為毛細支氣管炎治療療效評估的指標;后續(xù)研究可針對毛細支氣管患兒遠期預后展開[18]。

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（收稿日期：2018-10-30）