單海雷，焦光美，竇志杰，馬 征，張曉璇，楊 寧，高燕軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北承德 067000)

腦梗死是世界范圍內(nèi)人群死亡的主要原因之一，也是導(dǎo)致長(zhǎng)期神經(jīng)功能損傷的主要原因。多重因素導(dǎo)致的疾病復(fù)雜性阻礙腦梗死的診斷和治療[1]。雖然已開(kāi)展許多有關(guān)腦梗死治療的臨床試驗(yàn)，但目前血栓溶解仍是主要治療方法[2]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的有效的診斷和治療方法。微RNAs(microRNAs，miRNAs)是生物體內(nèi)廣泛存在的含19～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)域(3′UTR)結(jié)合，阻止它們的翻譯。miRNAs可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育、機(jī)體代謝和腫瘤發(fā)生。且近年來(lái)，許多研究已經(jīng)注意到miRNAs在腦梗死中的作用。腦缺血后，大腦中miRNAs的表達(dá)發(fā)生改變[3]。另外，有些miRNA在人體血清或血漿中穩(wěn)定存在，可以作為組織損傷和病理狀態(tài)的特異標(biāo)志物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181家族中，miR-181a對(duì)小鼠的缺血性神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[5]，下調(diào)的miR-181b通過(guò)對(duì)熱休克蛋白A5(HSPA5)和UCHL1蛋白水平的負(fù)調(diào)控，誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)對(duì)抗缺血性損傷，為缺血性腦卒中提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[6]。缺血后miR-181c直接作用于腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，從而調(diào)節(jié)小膠質(zhì)激活和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[7]。然而，miR-181家族的第4個(gè)重要成員miR-181d在腦缺血中的作用還鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)腦梗死患者和大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型小鼠血清中miR-181d的表達(dá)水平及其與炎癥的關(guān)系，初步揭示miR-181d在腦梗死中的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清標(biāo)本 采用回顧性研究方法，收集32例發(fā)病48 h內(nèi)入住承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的腦梗死患者血清(腦梗死損傷組)，其中男21例，女11例，年齡34～73歲，平均(54.0±18.7)歲。另選取體檢正常的健康對(duì)照人群13例收集血清(對(duì)照組)，男9例，女4例，年齡38～69歲，平均(53.0±14.7)歲。所有患者采血前均未進(jìn)行過(guò)擴(kuò)容、擴(kuò)血管及溶栓治療，無(wú)創(chuàng)傷及手術(shù)史；并且除外其他癌癥、感染或免疫疾病患者。兩組性別、年齡及高血壓、糖尿病、高血脂等并發(fā)癥比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，獲得患者或家屬的知情同意，同時(shí)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2小鼠MCAO模型 C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為20～25 g，于22～24 ℃正常晝夜交替環(huán)境飼養(yǎng)。稱(chēng)重后，按70 mL/kg腹腔注射5%水合氯醛。參照Longa線(xiàn)栓法建立小鼠左側(cè)MCAO模型。36只小鼠分為假手術(shù)組(n=6)和腦梗死組(n=30)。腦梗死組于梗死后1、3、7、14、28 d取材。

1.2方法

1.2.1血樣采集和血清總RNA提取 收集腦梗死患者發(fā)病48 h內(nèi)的靜脈血5 mL，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，4 ℃冰箱靜置30 min，3 000 r/min離心30 min，取上層血清置于無(wú)RNA酶離心管中，然后按照血清miRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)(北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。人胚腎HEK-293T細(xì)胞系購(gòu)自CBTCCCAS。這些細(xì)胞均用DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(FBS，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司上海分公司)]于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR) 從血清中提取的總RNA用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit(美國(guó)Applied biosystem公司)和miR-181d特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄成特異性產(chǎn)物。然后使用TaqMan miR-181d探針(美國(guó)Applied biosystem公司)在IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行qRT-PCR。整個(gè)反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 使用Abcam公司試劑盒(人TNF-α ELISA試劑盒ab46087；小鼠TNF-α ELISA試劑盒ab208348)檢測(cè)。使用每個(gè)樣品的3個(gè)平行樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建 包含miR-181d潛在結(jié)合位點(diǎn)的人TNF-α 3′-UTR序列是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，以HEK-293T細(xì)胞的DNA為模板。突變質(zhì)粒采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的快速突變系統(tǒng)生成。PCR產(chǎn)物通過(guò)SgfI和PmeI位點(diǎn)連接到psiCHECK-2載體上(美國(guó)Promega公司)。插入片段的序列通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)。所用引物：TNF-α-3′-UTR-WT-正向：5′-GAC CGC GAT CGC CCA CTA AGA ATT CAA ACT G-3′；TNF-α-3′-UTR-WT-反向：5′-CTT AGT TTA AAC CGA TTA CAG ACA CAA CT-3′；TNF-α-3′-UTR-Mut-正向：5′-TTT ATT ATT TAT TTA TTT ACA GAA CTT ACA ATT TAT TTG-3′；TNF-α-3′-UTR-Mut-反向：5′-CAA ATA AAT TGT AAG TTC TGT AAA TAA ATA AAT AAT AAA -3′。

1.2.6熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將含TNF-α 3′-UTR或其突變體的報(bào)告基因載體的psiChECK-2質(zhì)粒和miR-181d或?qū)φ漳M物一起，使用脂質(zhì)體2000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中。48 h后，用被動(dòng)裂解緩沖液100 μL(美國(guó)Promega公司)裂解細(xì)胞，然后按照Promega雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明書(shū)(美國(guó)Promega公司)檢測(cè)裂解液的熒光素酶表達(dá)水平(體系：20 μL；使用貝特霍爾德FB12光度計(jì)測(cè)量)。內(nèi)參為海腎熒光素酶。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 細(xì)胞吸去上層細(xì)胞培養(yǎng)基后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，然后加入RIPA裂解液，98 ℃變性10 min；用制備好的10%丙烯酰胺(SDS)膠板電泳(90 V電壓)；用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜過(guò)夜(100 V，4 ℃)；脫脂牛奶常溫封閉2 h；用含2%牛奶的PBS配置一抗過(guò)夜孵育;1‰ TBST洗膜3遍，每遍10 min，用含2%牛奶的PBS配置二抗，和膜室溫孵育2 h；再用1‰ TBST清洗膜3遍，每遍15 min。加入辣根過(guò)氧化物酶底物，反應(yīng)2 min，用上海勤翔ChemiScope 6000化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝光。

A：血清miR-181d表達(dá)水平比較；B：血清TNF-α表達(dá)水平比較；C：miR-181d和TNFα表達(dá)水平的相關(guān)性分析

圖1 腦梗死組與對(duì)照組血清miR-181d和TNF-α的表達(dá)及相關(guān)性分析

A：血清miR-181d表達(dá)水平比較；B：血清TNF-α表達(dá)水平比較；C：小鼠MCAO模型血清miR-181d和TNF-α表達(dá)水平的相關(guān)性分析；*：P<0.01，與假手術(shù)組比較

圖2 小鼠MCAO模型血清miR-181d和TNF-α的表達(dá)和相關(guān)性分析

2 結(jié) 果

2.1miR-181d、TNF-α在腦梗死損傷組與對(duì)照組血清的表達(dá)變化及相關(guān)性 腦梗死損傷組患者血清miR-181d表達(dá)水平低于對(duì)照組(P=0.015 7)，見(jiàn)圖1A。與對(duì)照組比較，腦梗死損傷組患者血清TNF-α表達(dá)水平升高(P=0.038 8)，見(jiàn)圖1B。進(jìn)一步對(duì)所有血清標(biāo)本miR-181d和TNF-α表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明TNF-α和miR-181d的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.703 8，P=0.000 4)，見(jiàn)圖1C。

2.2miR-181d和TNF-α在MCAO模型小鼠血清中的表達(dá)變化及相關(guān)性 利用qRT-PCR和ELSIA檢測(cè)假手術(shù)組和不同時(shí)段腦梗死組小鼠血清miR-181d和TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果表明，腦梗死組小鼠血清miR-181d表達(dá)水平低于假手術(shù)組，并且miR-181d表達(dá)水平隨著腦梗死發(fā)生時(shí)間的不斷增加而降低，見(jiàn)圖2A。與之相反，TNF-α在腦梗死組小鼠血清中的表達(dá)水平高于假手術(shù)組，并且隨著腦梗死發(fā)生時(shí)間的不斷增加而升高，見(jiàn)圖2B。在小鼠MCAO模型血清中，miR-181d和TNF-α的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=0.965 3，P=0.001 8)，見(jiàn)圖2C。

A：人類(lèi)TNF-α 3′-UTR的miR-181d結(jié)合位點(diǎn)模式圖，突變序列顯示在下方； B：報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-181d與TNF-α 3′-UTR的結(jié)合；C：100 nmol/L miR -181d的類(lèi)似物轉(zhuǎn)染到野生型的THP-1細(xì)胞中，qRT-PCR檢測(cè)miR-181d的表達(dá)；D：miR -181d的類(lèi)似物轉(zhuǎn)染到野生型的THP-1細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)TNF-α的表達(dá)；*：P<0.01，與Ctrl mimics比較

圖3 miR-181d通過(guò)結(jié)合到3′-UTR抑制TNF-α表達(dá)

2.3miR-181d對(duì)TNF-α的抑制作用 通過(guò)在線(xiàn)分析軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)搜索發(fā)現(xiàn)miR-181d潛在與TNF-α的3′UTR的500～507 bp位置發(fā)生結(jié)合，且進(jìn)化上高度保守(圖3A)。接下來(lái)構(gòu)建了野生型和突變型的TNF-α 3′UTR片段(針對(duì)miR-181d潛在結(jié)合位點(diǎn))，并將它們連接到報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK2上。然后同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-181d 模擬物或?qū)φ漳M物及含TNF-α 3′UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒于HEK-293T細(xì)胞中。檢測(cè)結(jié)果表明，miR-181d模擬物可以顯著抑制含野生型TNF-α 3′UTR的報(bào)告基因的活性，表明miR-181d可以與TNF-α 3′UTR結(jié)合。但是當(dāng)miR-181d的潛在結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，抑制作用減弱，說(shuō)明這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)miR-181d來(lái)說(shuō)，是十分重要的(圖3B)。進(jìn)一步在THP-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-181d(圖3C)，發(fā)現(xiàn)TNF-α的蛋白水平降低(圖3D)。

3 討 論

miRNA在腦發(fā)育和功能上起著十分關(guān)鍵的作用，血液循環(huán)中的大部分miRNA并不是從破碎的組織細(xì)胞被動(dòng)漏出，而是從受損組織細(xì)胞主動(dòng)分泌進(jìn)入血液循環(huán)，并進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮作用。本研究中結(jié)果顯示，腦梗死患者血清miR-181d的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照人群。此外，本研究成功建立了小鼠MCAO模型，在MCAO模型小鼠中血清miR-181d水平明顯低于假手術(shù)組，并且隨著病程的延長(zhǎng)持續(xù)降低。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)血清miR-181d的下調(diào)可以作為腦梗死的一個(gè)生物標(biāo)志物。本研究的不足之處在于沒(méi)有確定血清miR-181d下調(diào)的原因。另一方面，由于本研究所使用的臨床病例數(shù)較少，其結(jié)論的推廣確立有待擴(kuò)大樣本的前瞻性臨床研究證實(shí)。

研究表明炎癥是腦梗死的關(guān)鍵因素[8]，白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)等炎性因子均參與了腦梗死的發(fā)生、發(fā)展[9-12]；腦梗死患者血清TNF-α、IL-2、TGF-β1等水平明顯升高，TNF-α、IL-2、TGF-β1可促進(jìn)腦組織的炎性反應(yīng)及血管斑塊的形成，上述炎性因子的表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度及梗死面積相關(guān)。本研究在腦梗死患者血清標(biāo)本中同樣檢測(cè)到TNF-α表達(dá)水平升高。此外，在小鼠MCAO模型中血清TNF-α水平亦表現(xiàn)為上調(diào)。相關(guān)性分析顯示，在臨床樣本和小鼠模型中，miR-181d和TNF-α的表達(dá)均呈明顯負(fù)相關(guān)。說(shuō)明miR-181d和TNF-α之間存在著潛在的調(diào)控關(guān)系。關(guān)于這一點(diǎn)，在其他的研究和體系中也得到證實(shí)。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，HUTCHISON等[13]研究發(fā)現(xiàn)敲除miR-181可以增強(qiáng)高遷移率組蛋白B1(HMGB1)的產(chǎn)生并促使脂多糖(LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎性因子，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-181會(huì)導(dǎo)致炎癥抑制因子IL-10的表達(dá)升高。DAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥多導(dǎo)致的免疫麻痹過(guò)程中，烏本苷可以通過(guò)誘導(dǎo)miR-181的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致TNF-α mRNA水平的降解和蛋白水平的下調(diào)。然而，也有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-181和TNF-α在功能上也有可能存在正向的協(xié)同作用。GHORBANI等[15]發(fā)現(xiàn)在小鼠成纖維細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-181可以增強(qiáng)TNF-α所誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體膜電位的降低和隨后發(fā)生的細(xì)胞凋亡。本研究同時(shí)利用雙熒光酶報(bào)告基因和Western blot實(shí)驗(yàn)證明miR-181d可以通過(guò)與TNF-α mRNA的3′-UTR 區(qū)域相結(jié)合來(lái)抑制TNF-α的表達(dá)。說(shuō)明炎性細(xì)胞是血清中miR-181d作用的靶細(xì)胞之一。在正常的生理過(guò)程中，miR-181d的表達(dá)抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生。而在腦缺血疾病發(fā)生時(shí)，miR-181d的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，血清中miR-181d的表達(dá)也隨之降低，后者的表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞中TNF-α表達(dá)的升高。也就是說(shuō)，miR-181d的表達(dá)變化不僅可以作為臨床腦缺血性疾病的診斷和預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-181d不失為治療和改善腦梗死的一種潛在選擇。在后續(xù)的研究中，需要利用細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確miR-181d在腦梗死過(guò)程中所發(fā)揮的功能。另一方面，miR-181d作為miRNA，可以參與調(diào)控多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這方面有待進(jìn)一步的研究。

miR-181家族共有miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d四個(gè)miRNA。它們分別由不同染色體區(qū)域轉(zhuǎn)錄而成，且序列上高度相似。有關(guān)4種亞型在腦缺血性疾病研究中的深入程度有所不同，以miR-181a的研究最多。如小鼠腦卒中后，miR-181a抑制劑的治療可以改善小鼠的行為學(xué)指標(biāo)[5]。而OUYANG等[16]卻發(fā)現(xiàn)miR-181a可以通過(guò)靶向GRP78使腦缺血病情惡化。此外，MA等[17]研究表明在臨床腦卒中患者中miR-181c的表達(dá)升高，同時(shí)miR-181c可以促進(jìn)神經(jīng)瘤母細(xì)胞Neuro-2a的凋亡。在小鼠MCAO模型中，miR-181類(lèi)似物的處理可以降低小神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的激活并促進(jìn)凋亡細(xì)胞的表達(dá)[7]。本研究檢測(cè)到腦梗死患者和小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型血清miR-181d表達(dá)下調(diào)，血清TNF-α表達(dá)升高，并進(jìn)一步在人胚腎細(xì)胞(HEK-293T)細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中證明miR-181d可以抑制TNF-α的表達(dá)。結(jié)合前述報(bào)道，系統(tǒng)地闡明了miR-181家族各成員在腦缺血性疾病中的表達(dá)譜及其功能的差異。