魏成群，祝鴻雁黑龍江省醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036

阿爾茨海默病是一種極具隱匿性的、進(jìn)展緩慢的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也就是俗稱的“老年癡呆”，臨床中表現(xiàn)為記憶障礙、失語(yǔ)、執(zhí)行功能障礙、人格以及行為方面癡呆表現(xiàn)，多見(jiàn)于65歲以上人群，臨床中尚未明確其發(fā)病原因與發(fā)病機(jī)制[1-2]。但有研究指出，如果能通過(guò)臨床治療來(lái)促進(jìn)患者神經(jīng)元再生，可在一定程度上改善阿爾茨海默病的部分癥狀[3-5]。為此，該院于2016年4—5月以18只實(shí)驗(yàn)大鼠為研究對(duì)象，展開(kāi)了為期30 d的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

共選取18只符合納入標(biāo)準(zhǔn)大鼠為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，其中6只為正常大鼠，12只為阿爾茨海默病鼠，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，分別為正常參考組、AD鼠組和高壓氧治療組（AD鼠組和高壓氧治療組均從12只阿爾茨海默病數(shù)中分選）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①所有大鼠體重均在250～280 g之間。

②12只阿爾茨海默病鼠具有相應(yīng)特征，符合大鼠阿爾茨海默病標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 分選及標(biāo)記

18只實(shí)驗(yàn)用鼠，分為3組，每組6只：正常對(duì)照組；AD鼠組；高壓氧治療組；它們中每組取3只小鼠用Western-blotting檢測(cè)，其它注射Brdu用于免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。其中，一半鼠在Brdu注射1周后取材，剩余3周取材。所有老鼠都在同樣的條件下飼養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

①Brdu標(biāo)記及組織準(zhǔn)備。1.Brdu注射溶液配制；2.Brdu注射；3.實(shí)驗(yàn)鼠取材；4.組織冰凍切片。

②免疫熒光標(biāo)記。

③Western blotting技術(shù)標(biāo)記。

1.5 研究?jī)?nèi)容

給予AD鼠高壓氧治療后海馬齒狀回區(qū)域新生神經(jīng)元與正常組進(jìn)行對(duì)照，監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物腦內(nèi)海馬齒狀回區(qū)新生神經(jīng)元的生成，遷移，生長(zhǎng)與發(fā)育，發(fā)現(xiàn)高壓氧治療對(duì)成熟為功能神經(jīng)元的影響因素，改善新生神經(jīng)元發(fā)育，為AD治療提供依據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)輸入SAS9.1軟件處理。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)；定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；數(shù)據(jù)非正態(tài)分布取自然對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；組間比較兩因素設(shè)計(jì)的方差分析及兩兩比較。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)30 d的治療和觀察后，在高壓氧治療下，AD鼠馬齒狀回區(qū)新生神經(jīng)元有明顯增加，雖然神經(jīng)元數(shù)量仍低于正常參考組，但較AD鼠而言神經(jīng)元數(shù)量已有所增加，阿爾茨海默病鼠神經(jīng)元數(shù)量、躁動(dòng)情況較AD鼠組存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），這提示高壓氧治療可有效改善AD鼠癡呆癥狀。見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠海馬陽(yáng)性細(xì)胞及水迷宮逃避潛伏周期對(duì)比（±s）

表1 三組大鼠海馬陽(yáng)性細(xì)胞及水迷宮逃避潛伏周期對(duì)比（±s）

組別 BradU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逃避潛伏周期（min）AD 鼠組（n=6）高壓氧治療組（n=6）正常參考組（n=6）14.9±4.0 26.7±4.5 29.8±5.2 5.3±1.1 6.6±2.0 7.8±1.9 25.5±18.4 18.1±6.0 15.5±5.3

3 討論

3.1 研究背景

阿爾茨海默病是一種獲得性的持續(xù)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，患者可出現(xiàn)記憶衰退、認(rèn)知功能下降、行為障礙等表現(xiàn)，其病理改變以神經(jīng)元外形成大量老年斑和神經(jīng)元、突觸丟失凋亡有關(guān)。目前為止，大部分專家學(xué)者認(rèn)為Aβ沉積是阿爾茨海默病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，這與Aβ本身的神經(jīng)毒性作用有關(guān)。阿爾茨海默病機(jī)體海馬干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)明顯的增生、增值趨勢(shì)以應(yīng)對(duì)神經(jīng)功能的衰退，但是隨著時(shí)間的推移，老年海馬神經(jīng)干細(xì)胞增值能力會(huì)顯著降低，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度低于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡時(shí)，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)障礙，阿爾茨海默病就會(huì)發(fā)生。老年海馬體神經(jīng)元分化比例降低、新生神經(jīng)元存活率降低，同時(shí)由于新生神經(jīng)元突起生長(zhǎng)異常都是阿爾茨海默病的重要病理機(jī)制。

1950年左右一種用胸腺嘧啶核苷標(biāo)記分裂細(xì)胞的新方法應(yīng)用并加入到處于有絲分裂S期復(fù)制的DNA分子中，并且能通過(guò)放射顯影的方法檢測(cè)，于1961 Smart I等第一次在出生3 d的小鼠腦內(nèi)找到神經(jīng)元新生的證據(jù)[6]。1977年Kaplan和Hinds也在大鼠的嗅球，海馬以及新皮質(zhì)中證明神經(jīng)生成，并證明新生神經(jīng)元能存活較長(zhǎng)的一段時(shí)間，這些新生神經(jīng)元不但接受突觸傳入，還向它們的靶位點(diǎn)投射突觸信號(hào)。

神經(jīng)元新生階段的特異性目前還不清楚，阿耳茨海默?。ˋD）腦內(nèi)的神經(jīng)生成變化使這一過(guò)程得以進(jìn)行。因此，改善AD腦內(nèi)神經(jīng)生成微環(huán)境,保護(hù)早期殘留的較強(qiáng)的神經(jīng)新生功能，逆轉(zhuǎn)病理?yè)p傷造成的無(wú)效的神經(jīng)生成，使被激活的新生神經(jīng)元能夠大量存活下來(lái)，完成正常的發(fā)育步驟，成為正常功能性成熟神經(jīng)元，以彌補(bǔ)海馬的神經(jīng)元丟失，將是延緩病情和治療AD的關(guān)鍵[8]。

3.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

神經(jīng)生成僅在哺乳動(dòng)物的胚胎階段發(fā)生，成年哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)為非再生性組織，一旦成年腦組織損傷將永久失去神經(jīng)細(xì)胞，僅能以膠質(zhì)細(xì)胞增生來(lái)填充，成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不存在新生神經(jīng)元，這是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域恪守多年的神經(jīng)生物中心法則。

雖然神經(jīng)元細(xì)胞分布在成年神經(jīng)系統(tǒng)許多部位，但是神經(jīng)生成區(qū)域很有限，且不連續(xù)，分為神經(jīng)生成區(qū)和非神經(jīng)生成區(qū)。目前公認(rèn)的神經(jīng)神經(jīng)生成區(qū)有側(cè)腦室的腦室下區(qū)(SVZ）和海馬齒狀回（DG）的顆粒下層（SGZ）區(qū)。

在早年的研究中，有學(xué)者利用大鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)將大鼠置于有氧運(yùn)動(dòng)的環(huán)境下，使大鼠大腦供氧量增加，通過(guò)對(duì)比前后標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的有氧運(yùn)動(dòng)下，大鼠神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量會(huì)增加，增生量最高可差80%，同時(shí)在持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)下可明確觀察到大鼠神經(jīng)元細(xì)胞增殖過(guò)程，包括干細(xì)胞增殖、前體細(xì)胞存活和分化、新生神經(jīng)元細(xì)胞成熟、突觸形成和神經(jīng)回路整合等階段，且成熟后的新生神經(jīng)元細(xì)胞與成熟的顆粒細(xì)胞相似，能與CA3區(qū)神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系并產(chǎn)生突觸可塑性。因此可以認(rèn)定大鼠新生的神經(jīng)細(xì)胞可取代自然老化或凋亡的神經(jīng)元，使大腦神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)保持相對(duì)穩(wěn)定和完整。這一發(fā)現(xiàn)不僅打破了“神經(jīng)元是終極細(xì)胞”這一理念，更是為臨床治療阿爾茨海默病提供了關(guān)鍵性思路，即“氧”的環(huán)境支持。

近年來(lái)有研究指出腦缺血后會(huì)反應(yīng)性的產(chǎn)生比原來(lái)更多的神經(jīng)元前體細(xì)胞，它們中的一部分遷移進(jìn)入紋狀體和腦皮質(zhì)的缺血區(qū)域，并進(jìn)入海馬區(qū)進(jìn)入原來(lái)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，起到修復(fù)作用。這為阿爾茨海默病臨床提供了新的治療思路[9]。

3.3 該課題研究綜述及結(jié)果

該課題研究的基礎(chǔ)是在早年研究結(jié)論：氧環(huán)境對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞增生有支持作用的基礎(chǔ)上展開(kāi)設(shè)計(jì)，共選取18只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并劃分正常參考組、AD鼠組和高壓氧治療組，通過(guò)DCX和NeuN來(lái)標(biāo)記未成熟和成熟神經(jīng)元。用免疫熒光觀察DG區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以此評(píng)價(jià)各組新生神經(jīng)元的數(shù)量。用NeuN標(biāo)記“正常”的成熟神經(jīng)元和新生的成熟神經(jīng)元，通過(guò)對(duì)比新生神經(jīng)元和總量神經(jīng)元，并觀察不同時(shí)間段各自神經(jīng)元的數(shù)量，來(lái)觀察高壓氧治療后AD大鼠的神經(jīng)元再生情況。目的在于驗(yàn)證高壓氧環(huán)境下形成的“缺血”和“氧和”環(huán)境下AD大鼠腦神經(jīng)元的增生與分化的合理性和邏輯上的科學(xué)性。

結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)30 d的治療和觀察后，在高壓氧治療下，AD鼠馬齒狀回區(qū)新生神經(jīng)元有明顯增加，BradU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于對(duì)照組AD大鼠，3組大鼠BradU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為 （14.9±4.0）、（26.7±4.5）、（29.8±5.2），DCX 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為（5.3±1.1）、（6.6±2.0）、（7.8±1.9）； 水迷宮逃避潛伏周期分別為（25.5±18.4）min、（18.1±6.0）min、（15.5±5.3）min，組間對(duì)比存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這提示了高壓氧治療可有效緩解AD大鼠癡呆癥狀，也從側(cè)面印證了哺乳動(dòng)物神經(jīng)元具有循環(huán)、再生、可塑的可行性。

該實(shí)驗(yàn)探究結(jié)果與早年研究具有同一性。早年研究是通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)制AD大鼠大腦的供血情況與供氧情況得到改善，是一種主動(dòng)的大腦“氧”環(huán)境的改善，其證明了“氧”環(huán)境對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)元增生的促進(jìn)和支持作用，但并不能完全證實(shí)氧的積極作用，有氧運(yùn)動(dòng)牽涉到大鼠全身多個(gè)系統(tǒng)的運(yùn)作，可能是在共同作用下刺激神經(jīng)元再生并遷移、分化。而該組研究則是使大鼠處于高壓氧環(huán)境下，是一種被動(dòng)的、強(qiáng)制的AD大鼠腦部“氧”環(huán)境改善，因此本組實(shí)驗(yàn)中排除了共同作用使腦神經(jīng)元增生、遷移、分化的可能性，是對(duì)早年研究的進(jìn)一步探究和確認(rèn)。因此從某種意義上來(lái)說(shuō)，該組實(shí)驗(yàn)研究與早年研究結(jié)論具有同一性。

3.4 發(fā)展展望

目前對(duì)臨床診斷的阿爾茨海默病，治療方法有限，多數(shù)患者臨床癥狀呈慢性進(jìn)行性加重，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)AD鼠進(jìn)行高壓氧治療后新生神經(jīng)元變化的比較，對(duì)臨床日益多發(fā)的AD病人提供臨床治療依據(jù)。