張喜悅

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

1 醫(yī)用結(jié)核病疫苗研究現(xiàn)狀

全球范圍內(nèi)，結(jié)核病是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的十大原因之一，每年有數(shù)百萬(wàn)人患上結(jié)核病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，2017年全球約有1 000萬(wàn)人新感染結(jié)核，我國(guó)估計(jì)有88.9萬(wàn)人新感染結(jié)核[1]。然而，在過(guò)去的100年里，唯一實(shí)際應(yīng)用的疫苗仍然是卡介苗（Bacille calmette guerin，BCG）。近年來(lái)，隨著基因技術(shù)的進(jìn)步，學(xué)者們嘗試從多種途徑研發(fā)新型疫苗。常用的研發(fā)途徑有3種：一是對(duì)卡介苗進(jìn)行改進(jìn)，包括重組卡介苗，或者對(duì)野毒株進(jìn)行改進(jìn)，開(kāi)發(fā)出新的疫苗；二是使用病毒載體或結(jié)核免疫原性蛋白質(zhì)，加上必要的佐劑；三是開(kāi)發(fā)治療性疫苗，以減少結(jié)核病治療的持續(xù)時(shí)間。目前，進(jìn)入臨床試驗(yàn)的新型疫苗共有15種[1]，另外還有2種臨床試驗(yàn)終止疫苗（表1）。

2 牛結(jié)核病疫苗研究現(xiàn)狀

2.1 野生動(dòng)物疫苗

世界很多發(fā)達(dá)國(guó)家均較好地實(shí)施了牛結(jié)核病根除計(jì)劃。這些根除計(jì)劃是基于檢疫撲殺策略實(shí)施的。但該策略存在著很多問(wèn)題，如野生動(dòng)物宿主的存在嚴(yán)重影響牛結(jié)核病防控。英國(guó)和愛(ài)爾蘭的獾、新西蘭的刷尾負(fù)鼠、西班牙的野豬等均為牛結(jié)核病易感動(dòng)物宿主，且這些宿主持續(xù)向家畜傳播牛結(jié)核病，使得這些地區(qū)牛結(jié)核病的根除變得極為困難。因此，必須考慮對(duì)這些野生動(dòng)物應(yīng)用疫苗，以控制牛結(jié)核病。

用BCG免疫野生動(dòng)物，會(huì)導(dǎo)致野生動(dòng)物向家畜傳播BCG并存在干擾結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）的可能性，但這種情況尚未被證實(shí)。BCG可在某些種類(lèi)的野生動(dòng)物（白尾鹿）體內(nèi)，存活達(dá)9個(gè)月，并可傳播至其同群動(dòng)物。因此，在野生動(dòng)物免疫BCG的情況下，應(yīng)該考慮在該地區(qū)的牛中，也使用疫苗進(jìn)行免疫，以防止疫苗株由野生動(dòng)物向牛傳播。目前，新西蘭、英國(guó)和西班牙等地均已開(kāi)展了野生動(dòng)物免疫試驗(yàn)[5-6]。

新西蘭刷尾負(fù)鼠：1995—2002年，攻毒試驗(yàn)證實(shí)口服、注射和黏膜（如噴氣裝置）免疫有顯著效果；2009年，田間試驗(yàn)證實(shí)BCG免疫有69%～95%的效果?？诜囼?yàn)中，將BCG包裹于脂質(zhì)體中，可防止胃液失活疫苗活性。同時(shí)在誘餌上使用防水措施，并將誘餌掛于刷尾負(fù)鼠棲息地的樹(shù)上，這樣可有效提高免疫率。

英國(guó)獾：1998年至今，攻毒試驗(yàn)證實(shí)口服、注射和黏膜（如噴氣裝置）免疫有顯著效果。2011年，田間試驗(yàn)證實(shí)BCG免疫可使血清學(xué)陽(yáng)性率降低73.8%[5]。

表1 臨床和臨床終止階段的結(jié)核病新型疫苗研究狀況[2-4]

西班牙野豬：2009年至今，試驗(yàn)證實(shí)BCG可提供有效保護(hù)。2011年至今，證實(shí)滅活的牛分枝桿菌可提供類(lèi)似于BCG的保護(hù)作用。

2.2 牛疫苗

由于牛結(jié)核病疫苗會(huì)對(duì)PPD形成干擾，造成假陽(yáng)性，現(xiàn)在全球都禁止使用疫苗免疫牛。WHO也不贊同使用疫苗免疫牛，但很多學(xué)者仍然進(jìn)行了大量的牛結(jié)核病疫苗研究。

在過(guò)去的20年中，牛結(jié)核病疫苗研究取得了一些重要進(jìn)展，主要集中在減毒分枝桿菌菌株、DNA疫苗、亞單位疫苗（如培養(yǎng)濾液蛋白、MPB70）研發(fā)和免疫策略研究上。對(duì)于DNA和亞單位疫苗中不同免疫調(diào)節(jié)劑（如脂肽、CpG、菌落刺激因子等）的應(yīng)用，也進(jìn)行了廣泛研究。某些DNA、亞單位疫苗可明顯增強(qiáng)BCG的免疫效果，但單獨(dú)使用時(shí)其效果均弱于BCG。因此，當(dāng)前可以進(jìn)行田間應(yīng)用的免疫策略是單獨(dú)使用BCG，或者使用BCG初免、新型疫苗加強(qiáng)免疫的免疫策略。試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，腺病毒載體Ag85A疫苗，在攻毒試驗(yàn)中可以保護(hù)大部分牛免于形成結(jié)核病變[7-9]。

由于檢疫撲殺策略未能防止牛結(jié)核病流行，英國(guó)開(kāi)展了大量的牛結(jié)核病疫苗研發(fā)工作，如開(kāi)展了免疫保護(hù)試驗(yàn)[8]，以驗(yàn)證疫苗對(duì)牛的保護(hù)力。從2005年開(kāi)始，APHA即開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)對(duì)象為80頭免疫牛、64頭對(duì)照牛。攻毒試驗(yàn)中，80頭免疫牛中的29頭牛沒(méi)有病變，而64頭對(duì)照牛中，僅有2頭牛沒(méi)有病變。免疫牛中的無(wú)病變牛，細(xì)菌培養(yǎng)也呈陰性，表明BCG甚至在重度攻毒試驗(yàn)中，仍能提供有效保護(hù)。免疫后25 d可建立免疫反應(yīng)，基于可見(jiàn)病變減少的程度，表明疫苗的保護(hù)率為76%（50%～100%）。同其他動(dòng)物一樣，BCG對(duì)牛可以提供不同程度的保護(hù)，對(duì)部分牛只不產(chǎn)生保護(hù)。當(dāng)BCG接種于新生牛和犢牛時(shí)，其產(chǎn)生的保護(hù)作用要高于接種于成年牛；BCG Pasteur株和BCG Danish 株可以誘導(dǎo)相等的保護(hù)力，黏膜免疫也會(huì)產(chǎn)生保護(hù)力。BCG免疫會(huì)干擾PPD，且這種干擾至少會(huì)持續(xù)6個(gè)月。BCG的保護(hù)力與PPD陽(yáng)性情況并不相關(guān)，如皮膚試驗(yàn)陰性的BCG免疫動(dòng)物，仍然會(huì)像皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性的BCG免疫動(dòng)物一樣被保護(hù)。同時(shí)，還有試驗(yàn)認(rèn)為，BCG免疫后，其保護(hù)力可維持12個(gè)月，免疫24個(gè)月后保護(hù)力明顯下降。

增強(qiáng)BCG免疫效果的方法有兩個(gè)：一是初免時(shí)擴(kuò)大或加強(qiáng)免疫，二是在免疫效應(yīng)降低時(shí)加強(qiáng)免疫。新西蘭研究者認(rèn)為，小牛在6周后用BCG加強(qiáng)免疫，反而會(huì)影響初免時(shí)BCG的保護(hù)力。目前最成功的免疫策略是利用Ag85A病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫。APHA在過(guò)去6年的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BCG-病毒載體疫苗的免疫策略始終表現(xiàn)出強(qiáng)化BCG效果的效應(yīng)，如比BCG免疫更少的可見(jiàn)病變動(dòng)物和病理變化，且這種效應(yīng)與人醫(yī)疫苗的研究成果一致。因此，針對(duì)牛結(jié)核病，最有效的免疫策略是BCG初免，新型疫苗加強(qiáng)免疫。

但牛結(jié)核病疫苗的應(yīng)用，面臨著科學(xué)和法律法規(guī)的挑戰(zhàn)：一是必須要有適當(dāng)?shù)蔫b別診斷試劑，因?yàn)锽CG會(huì)干擾正常的PPD；二是歐盟國(guó)家禁止免疫牛，必須要改變這些法律法規(guī)；三是疫苗需要更多的安全性試驗(yàn)，以說(shuō)服決策者接受使用疫苗的建議。為此，歐盟開(kāi)展了結(jié)核病階梯項(xiàng)目（TBSTEP）[10]。該項(xiàng)目的主要目標(biāo)是研究根除牛結(jié)核病的適當(dāng)策略。項(xiàng)目組由多領(lǐng)域的成員組成，包括研發(fā)疫苗和診斷試劑的小組，其目標(biāo)為：（1）測(cè)試新型重組腺病毒疫苗（表達(dá)TB多重抗原），用于BCG初免以及病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫的牛免疫策略；（2）研發(fā)DIVA（鑒別診斷）試劑，以鑒別疫苗和野毒感染。此外，歐盟食品安全局于2013年向歐盟委員會(huì)提出建議，要求開(kāi)展牛結(jié)核病疫苗的田間試驗(yàn)[11]。同時(shí)，鑒于BCG Danish 1331是歐盟唯一的官方許可疫苗菌株，APHA向英國(guó)獸醫(yī)衛(wèi)生主管機(jī)構(gòu)提供了一系列資料，包括該疫苗的安全性和應(yīng)用數(shù)據(jù)，以獲得該疫苗作為牛結(jié)核病疫苗的獸用許可，同時(shí)申請(qǐng)開(kāi)展田間試驗(yàn)。