譚 珊，宋欣媛，張明通，吳培福

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224）

野生動(dòng)物是一種寶貴的生物資源，在保持生物多樣性與生態(tài)平衡中處于重要地位，對(duì)人類社會(huì)的持續(xù)發(fā)展有重要價(jià)值。動(dòng)物園是飼養(yǎng)野生動(dòng)物的重要場(chǎng)所，同樣也流行一些動(dòng)物疾病，其中大腸桿菌病較為普遍。致病性大腸桿菌能引起動(dòng)物嚴(yán)重腹瀉、蜂窩織炎、腫頭綜合征、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、臍帶炎、眼炎、纖維蛋白性心包炎和敗血癥等[1]，給動(dòng)物健康造成了嚴(yán)重影響。大腸桿菌的致病性由多種毒力因子共同決定。在大腸桿菌侵襲宿主組織并引起發(fā)病的過(guò)程中，這些毒力因子相互協(xié)調(diào)，共同發(fā)揮作用，幫助微生物逃避或破壞宿主防御機(jī)制，進(jìn)而引發(fā)對(duì)宿主有害的炎癥[2]。因此，開展野生動(dòng)物疾病防治研究，可以為保護(hù)野生動(dòng)物和人類自身健康提供技術(shù)保障。本研究以昆明市圓通山動(dòng)物園內(nèi)37種不同動(dòng)物源糞樣中分離鑒定的大腸桿菌為研究對(duì)象，分析分離株毒力基因的流行病學(xué)特征，以期為動(dòng)物園動(dòng)物大腸桿菌病治療和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年3月，在圓通山動(dòng)物園，隨機(jī)無(wú)菌采集37種動(dòng)物糞便樣品各3份（表1）。

1.2 培養(yǎng)基制備

麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基等：均購(gòu)于云南凌普生物科技有限公司，按常規(guī)方法配制。

1.3 細(xì)菌分離

挑取0.1 g糞樣于2 mL離心管中作105倍稀釋，將得到的樣品稀釋液，運(yùn)用平板劃線法，通過(guò)伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、麥康凱培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察，初步篩選大腸桿菌。

1.4 細(xì)菌生化試驗(yàn)

根據(jù)《腸科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》進(jìn)行生化鑒定，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)等。

表1 采集樣品的動(dòng)物園動(dòng)物種類

1.5 PCR鑒定

根據(jù)GenBank中大腸桿菌的ECO和Uid基因序列[3]，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，序列見表2。

表2 大腸桿菌鑒定引物

1.6 毒力基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）毒力因子調(diào)查與分析[4]，將毒力引子劃分為：粘附素類基因（fimA、fimH、papA、papC、sfa等），鐵獲得系統(tǒng)類基因（irp-2、fyuA、iucA、iucD、iutA、iroN等），溫度敏感血凝素（tsh），血清抗性蛋白（iss），腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島（eaeA），毒素（vat、stx2f、astA），大腸桿菌素V（colv、colBM），溶血素（hlyE），外膜蛋白（traT），保護(hù)素（kpsmT-K1、kpsmT II）， 侵 襲 素（ibeA）。 采 用 Primer-Blast設(shè)計(jì)引物并計(jì)算理論退火溫度。引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，引物序列設(shè)計(jì)見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離與生化鑒定

從37種動(dòng)物糞樣中，共分離純化出37株大腸桿菌。通過(guò)伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、麥康凱培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)特性觀察，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）上，菌落中心呈深紫或無(wú)明顯暗色中心，菌落呈圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)，常有綠色金屬光澤；在麥康凱培養(yǎng)基上，菌落為鮮桃紅或微紅色，中心為深桃紅色，菌落呈圓形、扁平，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)；革蘭染色均為陰性。生化鑒定結(jié)果符合大腸桿菌特性（表4）。

表4 大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

2.2 PCR檢測(cè)

擴(kuò)增的ECO和Uid目的條帶大小分別為232 bp和293 bp，與預(yù)期目的片段大小一致（圖5、圖6），表明分離菌均為陽(yáng)性。PCR檢測(cè)與生化鑒定結(jié)果相符，確定分離的病原菌為大腸桿菌。

表3 毒力基因PCR引物

圖5 ECO基因片段電泳結(jié)果

圖6 Uid基因片段電泳結(jié)果

2.3 毒力基因分布

2.3.1 毒力基因檢測(cè) 對(duì)分離鑒定出的37株大腸桿菌，利用19對(duì)毒力基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：37株菌的ompA基因檢測(cè)全部為陽(yáng)性，ibeA、neuC、iutA、traT、stx檢測(cè)全部為陰性；35株細(xì)菌（94.59%）檢出iroN陽(yáng)性，31株（83.78%）檢出 fimC陽(yáng)性，26株（70.27%）檢出aatA陽(yáng)性，19株（51.35%）檢出vat陽(yáng)性，13株（35.14%）檢出fyuA陽(yáng)性，6株（16.22%）檢出tsh陽(yáng)性，其他基因的檢測(cè)結(jié)果見表5。

2.3.2 同時(shí)攜帶毒力基因數(shù)量分布 運(yùn)用PCR方法對(duì)37株大腸桿菌分離株的ompA等19種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算19種毒力基因的共攜帶率。結(jié)果顯示：同時(shí)攜帶大于或等于10個(gè)毒力基因的大腸桿菌有3株（8.10%），攜帶5～8個(gè)的有22株（59.46%），攜帶5個(gè)以下的有12株（32.43%），具體結(jié)果見表6。此次檢測(cè)的19個(gè)毒力基因中，強(qiáng)毒力島基因分別是tsh、iroN、fyuA、iucD、irp2、traT、iss 7種。在37個(gè)分離株中，同時(shí)攜帶6種強(qiáng)毒力島基因的有3株，攜帶3～4種的有6株，攜帶2種的有9株，只攜帶1種的有18株，只有豪豬糞樣中分離的1株菌株沒有攜帶強(qiáng)毒力島基因。強(qiáng)毒力島基因中，iroN的檢出率最高，為94.59%，traT未檢出，其余的依次為fyuA（35.14%）、iucD（24.32%）、irp2（18.92%）、iss（18.92%）、tsh（16.22%）。

表5 19種毒力基因檢出率情況

2.3.3 毒力基因的動(dòng)物種間分布 對(duì)37種動(dòng)物糞樣分離提取的大腸桿菌攜帶毒力基因情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，棕樹鳳頭鸚鵡中分離的大腸桿菌攜帶的毒力基因數(shù)最多（12個(gè)），其次是赤猴（11個(gè)）、馬來(lái)熊（10個(gè)），最少的是老虎（2個(gè)），其余動(dòng)物中大腸桿菌的攜帶情況見表7。

表6 同時(shí)攜帶毒力基因數(shù)量分布

表7 不同動(dòng)物源大腸桿菌毒力因子攜帶情況

3 討論

細(xì)菌毒力的強(qiáng)弱很大程度上取決于其所攜帶的毒力因子（VFs）[5]。目前，致病性大腸桿菌的毒力因子主要?jiǎng)澐譃轲じ剿兀?fim、ompA）、溫度敏感血凝素（tsh、iutA）、攝鐵系統(tǒng)（耶爾森強(qiáng)毒力島基因irp2、fyuA）、侵襲因子（ibeA）、血清抗性蛋白（iss）、毒素和大腸桿菌素。

本研究對(duì)37株不同動(dòng)物源糞樣大腸桿菌分離株進(jìn)行19種毒力基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢出率相對(duì)較高的依次為ompA（100%）、iroN（94.59%）、 fimC（83.78%）、aatA（70.27%）、vat（51.35%），其他的均在35.14%以下。由此可以看出，ompA、iroN、 fimC基因在圓通山動(dòng)物園的致病性大腸桿菌中最為常見。 fimC、kspM、papC是菌毛蛋白基因，aatA是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，tsh、iroN、fyuA、iucD、irp2、traT、iss 7種基因?qū)儆趶?qiáng)毒力島基因[6]。7種強(qiáng)毒力島基因中有6種在分離株中被檢測(cè)出來(lái)，其中iroN的攜帶率最高，為95.49%，其余5種的攜帶率也較高，說(shuō)明動(dòng)物園動(dòng)物攜帶了不同致病性的大腸桿菌。

研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物大腸桿菌病的致病力與其攜帶的毒力因子種類及數(shù)量密切相關(guān)，涉及的基因主要有 iutA、tsh、iroN、cvaC、astA、iss、irp2、papC、iucD、vat等。董向磊[7]研究認(rèn)為，在iutA、iss、tsh、iroN、irp2、cvaC 6種毒力基因中，如果APEC分離株同時(shí)攜帶有2種以上毒力基因，則有89.74%的概率認(rèn)定該分離株具有致病性，誤差率為7.90%。

根據(jù)不同動(dòng)物大腸桿菌毒力基因攜帶情況，結(jié)合相關(guān)研究推斷，動(dòng)物園動(dòng)物中，棕樹鳳頭鸚鵡、赤猴、馬來(lái)熊、麋鹿、緋胸鸚鵡、野豬等攜帶的毒力基因數(shù)量最多，由大腸桿菌致病的風(fēng)險(xiǎn)較高，豪豬、老虎、耳廓狐、環(huán)尾狐猴、灰葉猴、黑毛仙猴、黑葉猴等相對(duì)較低。導(dǎo)致這個(gè)結(jié)果的原因可能與它們的生活環(huán)境有關(guān)。生活環(huán)境較為密閉的動(dòng)物，如老虎、耳廓狐、環(huán)尾狐猴、灰葉猴、黑毛仙猴、黑葉猴等動(dòng)物體內(nèi)的大腸桿菌攜帶的毒力基因種類較少，而生活環(huán)境與外界接觸較大的動(dòng)物，如赤猴、馬來(lái)熊、麋鹿等體內(nèi)的大腸桿菌攜帶的毒力基因種類較多，更容易患病。也有可能與動(dòng)物自身的適應(yīng)能力和抵抗力有關(guān)。有些動(dòng)物比較適應(yīng)昆明市的氣候條件，抵抗力更強(qiáng)，患病率低，而有些動(dòng)物不能適應(yīng)昆明市的氣候條件或者抵抗力太差，則患病率高，需要改善飼養(yǎng)條件，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高其抵抗力。

4 結(jié)論

本研究從圓通山動(dòng)物園37個(gè)動(dòng)物種群糞便中分離鑒定出37株大腸桿菌，并對(duì)19種毒力基因的攜帶情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)昆明市圓通山動(dòng)物園內(nèi)流行的大腸桿菌以致病菌為主，不同種類動(dòng)物體內(nèi)大腸桿菌的毒力基因攜帶率存在較大差異，其原因可能與動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境以及動(dòng)物自身的適應(yīng)能力和抵抗力有關(guān)。因此，對(duì)于棕樹鳳頭鸚鵡、赤猴、馬來(lái)熊、麋鹿、緋胸鸚鵡、野豬等具有較高大腸桿菌致病風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物，要采取相應(yīng)防治措施，加強(qiáng)預(yù)防和控制，防止大腸桿菌病發(fā)生與流行。