蔣文明，李 陽(yáng)，李金平，袁麗萍，侯廣宇，程善菊，劉華雷

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國(guó)家禽流感專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266032）

2013年我國(guó)在人群病例和家禽中檢測(cè)到H7N9流感病毒。雖然動(dòng)物攻毒試驗(yàn)證明，從家禽中分離到的H7N9流感病毒對(duì)家禽無(wú)致病力，但還是給家禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。隨著H7N9流感病毒的演變，在經(jīng)歷了3年多時(shí)間之后，2016年底，H7N9流感病毒從弱毒株變異為強(qiáng)毒株，并開(kāi)始在多地引發(fā)了家禽高致病性H7N9流感疫情。

當(dāng)前，各地家禽的H7N9流感疫情仍時(shí)有發(fā)生。對(duì)H7N9流感及早做出診斷是做好該病防控和切實(shí)保障養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要內(nèi)容，因此建立H7N9流感病毒快速檢測(cè)方法十分必要。前期，本實(shí)驗(yàn)室建立了一種能同時(shí)鑒別H7亞型和N9亞型流感病毒的雙重RT-PCR方法[2]，以及一種H7亞型流感病毒通用及區(qū)分強(qiáng)弱毒株的RT-PCR方法[3]。這些普通RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要電泳等開(kāi)放的環(huán)節(jié)程序，容易對(duì)周?chē)h(huán)境造成核酸污染。而其他方法，如病毒分離、動(dòng)物試驗(yàn)等方法，耗時(shí)更長(zhǎng)、要求更高。本研究建立了一種可以區(qū)分H7亞型流感病毒強(qiáng)弱毒株的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。該方法檢測(cè)需時(shí)短，僅需1臺(tái)熒光PCR儀即可在密閉反應(yīng)管中快速完成，且在檢測(cè)過(guò)程中可實(shí)時(shí)查看反應(yīng)曲線，快速做出結(jié)果判斷，對(duì)疾病的快速診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒

H7N9、H5N6、H9N2等亞型流感病毒，以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒：均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要試劑盒

QIAamp Viral RNA Mini Kit：購(gòu)自 Qiagen 公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit：購(gòu)自Vazyme公司；TOPO載體克隆試劑盒：購(gòu)自Clone Smarter公司；禽流感（AIV-H7）核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自深圳匹基生物工程股份有限公司（批號(hào)20171102）；禽流感病毒H7亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司（批號(hào)AIVH7 20180703P）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)表的序列以及本實(shí)驗(yàn)室分離毒株序列，比較H7亞型高致病性毒株和低致病性毒株HA核苷酸序列（主要差異在HA裂解位點(diǎn)處），在保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，在HA裂解位點(diǎn)處設(shè)計(jì)2條探針（專(zhuān)利申請(qǐng)中，待公開(kāi)）。探針5'端分別標(biāo)記FAM和Cy5，3'端分別標(biāo)記BHQ1和BHQ2。

1.4 單重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的建立

根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說(shuō)明，提取H7N9流感強(qiáng)毒株和弱毒株的RNA。在反應(yīng)體系中依次加入 2×qRT-PCR Buffer 25.0 μL、水 6.5 μL，引物、探針各 2.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 2.5 μL，最后加入 RNA 模板 10 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 10 min，95 ℃ 2 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，收集熒光信號(hào)）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接TOPO載體進(jìn)行測(cè)序。

1.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別方法的建立及優(yōu)化

在反應(yīng)體系中依次加入2×qRT-PCR Buffer 25.0 μL、水4.5 μL，引物、探針各2.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 2.5 μL，最后加入H7N9流感強(qiáng)毒株或弱毒株RNA模板10 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 10 min，95 ℃ 2 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，收集熒光信號(hào)）。

對(duì)反應(yīng)體系中的不同引物、探針濃度組合（引物 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L， 探 針 1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L）和擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)參數(shù)（反轉(zhuǎn)錄5、10、15 min，退火延伸20、30 s）等條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)組合。

1.6 敏感性試驗(yàn)

提取H7N9流感病毒RNA，用微量核酸分析儀測(cè)定病毒RNA含量。將RNA作10倍倍比稀釋?zhuān)?0.0 μL稀釋后的RNA模板，加入到40.0 μL qRT-PCR預(yù)混液中，采用建立的熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定其靈敏度。

1.7 特異性試驗(yàn)

利用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，分別檢測(cè)H7N9（3株強(qiáng)毒和3株弱毒）、H5N6（5株）、H9N2（5株）等亞型流感病毒，以及新城疫病毒（2株）、禽傳染性支氣管炎病毒（2株）、傳染性法氏囊病毒（2株）等常見(jiàn)禽類(lèi)病毒，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.8 與臨床同類(lèi)試劑盒的比較

以上述1.6中10倍比稀釋的RNA為模板，對(duì)比本研究建立的方法與禽流感（AIV-H7）核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）、禽流感病毒H7亞型實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）兩種試劑盒的敏感性。以實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序確定的40株H7N9流感病毒（強(qiáng)毒株和弱毒株各20株）RNA為模板，對(duì)比該方法與兩種試劑盒的特異性。

1.9 臨床應(yīng)用

對(duì)2015—2017年收集的臨床疑似高致病性H7N9流感發(fā)病家禽樣品20份（來(lái)自養(yǎng)殖場(chǎng)的雞組織樣品），利用建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與病毒分離測(cè)序方法進(jìn)行比較，檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 單重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的建立

為驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針的設(shè)計(jì)，選取實(shí)驗(yàn)室保存的H7N9流感強(qiáng)毒和弱毒進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在單重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法中，H7N9流感強(qiáng)毒和弱毒的引物探針均能有效檢出所對(duì)應(yīng)的病毒，且無(wú)交叉反應(yīng)（圖1）。

為進(jìn)一步說(shuō)明反應(yīng)的特異性和準(zhǔn)確性，將熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)H7N9流感強(qiáng)毒和弱毒均在約90 bp處看到1條特異性擴(kuò)增條帶（圖2）。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接TOPO載體測(cè)序，比對(duì)發(fā)現(xiàn)該擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)為H7N9流感病毒HA基因序列，表明本研究設(shè)計(jì)的H7引物特異性強(qiáng)，也說(shuō)明該熒光RTPCR方法特異、準(zhǔn)確。

2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別方法的建立及優(yōu)化

圖2 H7N9流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別反應(yīng)體系中，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中的不同引物、探針濃度組合擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)參數(shù)和循環(huán)次數(shù)的條件摸索和優(yōu)化，建立了鑒別H7N9流感強(qiáng)弱毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的最適引物濃度均為0.4 μmol/L，探針濃度均為0.3 μmol/L。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的最佳反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)為：第1階段，反轉(zhuǎn)錄50 ℃/10 min；第2階段，預(yù)變性95 ℃/2 min；第3階段，95 ℃/10 s，60 ℃/30 s，40個(gè)循環(huán)。在第3階段的每次循環(huán)退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果，以出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤38判為陽(yáng)性。

2.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別方法的特異性試驗(yàn)

利用建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，分別檢測(cè)H5N6、H7N9、H9N2等亞型的流感病毒，以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒，發(fā)現(xiàn)該方法只能對(duì)應(yīng)擴(kuò)增H7N9流感強(qiáng)毒（3株）或弱毒（3株），對(duì)其他亞型禽流感病毒及其他禽病病毒擴(kuò)增均為陰性（圖3），表明該方法具有良好的特異性。

2.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別方法的敏感性試驗(yàn)

圖3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定病毒的RNA濃度，將提取的RNA依次做10倍倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取6 μL作為模板進(jìn)行檢測(cè)，以出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤38判為陽(yáng)性。結(jié)果顯示，該方法對(duì)H7N9流感強(qiáng)毒HA基因的檢測(cè)下限是0.004 fg RNA模板，對(duì)H7N9流感弱毒HA基因的檢測(cè)下限是0.1 fg RNA模板（圖4）。

2.5 與其他試劑盒的對(duì)比

將上述1.6中的RNA依次做10倍倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取6 μL作為模板，分別用兩種商品化的H7亞型流感病毒熒光RT-PCR試劑盒與本研究建立的方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，針對(duì)H7N9流感弱毒株，本方法比兩種試劑盒的靈敏度均提高了10倍；針對(duì)H7N9流感強(qiáng)毒株，本方法與深圳匹基生物工程股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒靈敏度相當(dāng)，但比北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒靈敏度提高了10倍（圖5），說(shuō)明該方法具有良好的敏感性。

圖4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序確定的40株H7N9流感病毒（強(qiáng)毒株和弱毒株各20株）RNA為模板，對(duì)比該方法與兩種試劑盒的特異性。結(jié)果顯示，H7N9流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸快速檢測(cè)方法可以將20份H7N9流感強(qiáng)毒和20份H7N9弱毒全部檢出，檢出率和符合率均為100%。兩家公司生產(chǎn)的試劑盒雖然可以全部檢出病毒，但不能區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株。結(jié)果表明，本研究篩選的引物和探針能對(duì)目前的H7N9流感強(qiáng)弱毒株進(jìn)行有效區(qū)分和檢測(cè)。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

用上述H7N9流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸快速鑒別方法，對(duì)20份臨床發(fā)病組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出4份強(qiáng)毒、3份弱毒（圖6）。將20份組織樣品研磨后接種10日齡SPF雞胚，分離病毒；提取血凝陽(yáng)性的尿囊液核酸，按照參考文獻(xiàn)[3]中的方法，對(duì)HA基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果也顯示為4份強(qiáng)毒、3份弱毒，二者檢測(cè)結(jié)果一致，且為對(duì)應(yīng)關(guān)系，符合率為100%，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

3 討論

圖5 兩種商品化H7亞型流感病毒熒光RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖6 該方法對(duì)臨床組織樣品的檢測(cè)

對(duì)比H7N9流感強(qiáng)弱毒株HA基因序列發(fā)現(xiàn)，二者序列的差異主要體現(xiàn)在裂解位點(diǎn)處序列的不同。強(qiáng)毒株是在裂解位點(diǎn)處插入了12個(gè)堿基（編碼4個(gè)氨基酸），并有多個(gè)堿基的突變，導(dǎo)致裂解位點(diǎn)處出現(xiàn)了多個(gè)堿性氨基酸，致使毒力增加[4]。本研究根據(jù)H7N9流感強(qiáng)弱毒株HA基因裂解位點(diǎn)及兩側(cè)區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物及2條探針，對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，建立了可以區(qū)分強(qiáng)弱毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)方法。

該方法具有良好的特異性，可以區(qū)分H7N9流感強(qiáng)弱毒株，與H5、H9等亞型禽流感病毒以及其他禽病病原核酸，如新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)。該方法對(duì)H7N9流感強(qiáng)毒和弱毒HA基因的檢測(cè)下限分別為0.004和0.1 fg RNA模板，敏感性優(yōu)于深圳匹基生物工程股份和北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司的同類(lèi)商品化試劑盒。

常規(guī)RT-PCR方法雖然也可以檢測(cè)H7N9流感病毒，甚至可以直接區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要電泳等開(kāi)放的環(huán)節(jié)程序，容易對(duì)周?chē)h(huán)境造成核酸污染。本研究建立的可以區(qū)分H7N9流感病毒強(qiáng)毒株和弱毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于H7N9流感的流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測(cè)、早期診斷和有效防控具有重要意義。