王楷宬，王素春，朱 琳，仲煥香，黃保續(xù)

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為單股負(fù)鏈RNA病毒，由 8個(gè)獨(dú)立的RNA節(jié)段組成。該病毒的顯著生物學(xué)特征之一是亞型眾多、變異頻繁。迄今為止從禽類體內(nèi)已經(jīng)分離到上千種毒力各異的毒株，根據(jù)病毒粒子表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，將其分為18種HA亞型（H1～H18）和11種 NA 亞型（N1～N11）[1-3]。

禽流感分布很廣，世界各地均有分離出該病病原的報(bào)道。其病原致病性有高致病性和低致病性之分。禽流感的發(fā)生給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）報(bào)告，2003—2004年禽流感在越南暴發(fā)導(dǎo)致的損失預(yù)計(jì)為該國(guó)GDP的0.3%～1.8%[4]。禽流感暴發(fā)對(duì)我國(guó)家禽養(yǎng)殖農(nóng)戶的生計(jì)也造成了巨大沖擊，農(nóng)戶家禽養(yǎng)殖收入和家庭收入均顯著下降。在控制其他變量的條件下，1次禽流感發(fā)生會(huì)造成農(nóng)戶人均家禽養(yǎng)殖收入平均降低65%，農(nóng)民人均收入下降29%[5]。

同亞型毒株對(duì)宿主的致病力差異顯著。在所有HA亞型中，只有H5和H7亞型對(duì)禽是高致病性的，稱為高致病性禽流感（High pathogenic avian in fluenza，HPAI）。該類病毒可引起雞群100%死亡，因而HPAI被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病。此外，禽流感的危害不僅是對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的破壞，還對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅[6-7]。

快速檢測(cè)是有效防控動(dòng)物和人類禽流感的關(guān)鍵因素之一。為滿足AIV的高通快速檢測(cè)與應(yīng)急響應(yīng)，本研究建立了AIV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，評(píng)估了該方法的檢測(cè)下限與特異性，并進(jìn)行了臨床應(yīng)用檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑：均購(gòu)自Life technologies公司；超凈工作臺(tái)：美國(guó)Forma Scientific公司產(chǎn)品；移液器：Eppendorf公司產(chǎn)品；孵化器：德州誠(chéng)信孵化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高速臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Heraeus Biofuge primoR公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀：Bio-Rad CFX96 Realtime PCR System；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Primescript One step RTPCR Kit Ver.2：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品；Low-Pro file PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD公 司 產(chǎn) 品；Optically clear flat 8 Cap Strips：Thermo Scientific公司產(chǎn)品；異丙醇、無水乙醇、RNaseA等：均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 毒株與核酸提取

各亞型流感病毒、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、 傳 染 性 喉氣 管 炎 病 毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）毒株：由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存，毒株詳細(xì)信息見表1。按照說明書操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，并使用Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑測(cè)定RNA濃度。

1.3 引物與探針篩選

從GenBank中下載不同亞型、不同國(guó)家、不同分離時(shí)間的AIV毒株M基因序列共1 641條，采用MEGA 6.0[8-9]進(jìn)行序列比對(duì)，選取保守區(qū)域進(jìn)行熒光定量檢測(cè)引物和探針設(shè)計(jì)，并對(duì)多條引物、探針進(jìn)行組合、篩選與檢驗(yàn)，以期篩選出最優(yōu)引物和探針。

1.4 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

配制熒光定量RT-PCR反應(yīng)液，每管25 μL：含 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，5 U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，10 pmol/μL M forward、M reverse和 M probe 各 0.5 μL，RNase Free dH2O 8.0 μL，待檢測(cè)樣品RNA模板2 μL。將檢測(cè)反應(yīng)條件設(shè)置為：第1階段，42 ℃/5 min；第2階段，95 ℃/10 s；第3階段，95 ℃/5 s，60 ℃/20 s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)。無Ct值并且無擴(kuò)增曲線時(shí)，樣品判為陰性；Ct值≤36，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，樣品判為陽性。

1.5 特異性與靈敏度評(píng)估

采用上述反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，檢測(cè)表1中的病毒RNA，以評(píng)估該檢測(cè)方法的特異性。提取的核酸經(jīng)Qubit核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度后，將此病毒RNA稀釋成1 ng/μL，再10倍梯度稀釋成 10-1～10-6ng/μL；分別取 2 μL 作為反應(yīng)模板，按照前述加樣方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR核酸擴(kuò)增。

表1 禽流感病毒毒株信息

1.6 臨床樣品檢測(cè)

采集我國(guó)華東某市4個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)的雞咽喉拭子共94份，置于含有10%甘油和抗生素（含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL，BSA 5 mg/mL） 的 PBS（pH7.2）緩沖液中，-80 ℃保存。將采集的樣品渦旋混勻后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min；取上清，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸[10]，-80 ℃保存。使用96孔反應(yīng)管加入上述反應(yīng)體系，分別加入待檢樣品RNA進(jìn)行檢測(cè)。用該方法與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》（NY/T772—2013）中的方法，同時(shí)對(duì)94份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，分析本試驗(yàn)建立方法在臨床檢測(cè)中的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針篩選

最終篩選出最適合的引物（M forward、M reverse）和探針（M probe），序列已申請(qǐng)發(fā)明專利（表2），其中M probe為TaqMan熒光探針，標(biāo)記ROX熒光。

表2 最適引物及探針序列

2.2 特異性與靈敏度

結(jié)果顯示，除了各亞型AIV RNA模板對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組出現(xiàn)了正常熒光檢測(cè)曲線外，其他非特異性病毒的試驗(yàn)組及陰性對(duì)照組均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明，此方法不與其他相關(guān)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)AIV的特異性檢測(cè)（圖1）。

本研究篩選的引物和探針組合能夠保證檢測(cè)時(shí)的靈敏性，檢測(cè)靈敏度為RNA終濃度10-4ng/μL（圖2）。

圖1 AIV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 AIV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 臨床樣品檢測(cè)

用本試驗(yàn)建立的AIV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T772—2013中的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，對(duì)94份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致，陽性符合率為100%（表3）。共檢測(cè)96份樣品，其中94份臨床拭子樣品、1個(gè)AIV陽性對(duì)照、1個(gè)AIV陰性對(duì)照，而本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法耗時(shí)約1 h。部分檢測(cè)結(jié)果見圖3。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且靈敏度高，特異性和可靠性更強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)，自動(dòng)化程度高，無污染性，同時(shí)具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[11]。

本研究在分析大量AIV流行毒株序列基礎(chǔ)上，篩選出一組特異性好、檢測(cè)下限達(dá)10-4ng/μL的探針、引物，建立了高通量檢測(cè)方法，并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。該方法能夠檢測(cè)各亞型AIV，與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T772—2013中的傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)陽性符合率達(dá)100%，且能在1 h內(nèi)完成對(duì)未經(jīng)培養(yǎng)臨床樣品的高通量檢測(cè)，能夠滿足大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的需要。

表3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

圖3 部分臨床樣品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)已逐漸使用TaqMan熒光探針代替SYBR Green染色，使用TaqMan熒光探針，較傳統(tǒng)SYBR Green染色法，可避免污染并且能夠提高特異性。目前關(guān)于檢測(cè)所有亞型AIV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的報(bào)道較少。Nagy等[12]曾建立一種使用TaqMan熒光探針的AIV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其檢測(cè)下限能夠達(dá)到5拷貝/反應(yīng)，也能達(dá)到良好的檢測(cè)效果。本研究使用TaqMan熒光探針，檢測(cè)靈敏度也達(dá)到了10-4ng/μL，特異性也較好。

流感病毒曾在20世紀(jì)引起4次疫病大流行，包括1957年的H2N2、1968年的H3N2以及1918年和2009年的H1N1，導(dǎo)致數(shù)百萬人死亡。1997年暴發(fā)的H5N1禽流感疫情造成18人感染、6人死亡，這也是全球首次發(fā)現(xiàn)AIV能夠傳染給人[13]。我國(guó)被認(rèn)為是容易產(chǎn)生新型流感病毒的區(qū)域[14]。新型或變異AIV目前在我國(guó)廣泛存在，有些甚至?xí)?dǎo)致人類感染，如H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8和H5N6等[15]。因此，建立能檢測(cè)所有亞型AIV的檢測(cè)方法有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)這些變異和新型AIV毒株。