楊曉滿，楊曉婷，趙可及，李加友，于建興

(嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

生物胺是一類具有生物活性、含氨基的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物的總稱，包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、組胺、色胺等[1]，廣泛存在于食品中，過量的生物胺會(huì)使人體中毒，引起頭疼、血壓變化、呼吸紊亂、心悸、嘔吐等嚴(yán)重反應(yīng)[2]，其中組胺和酪胺的生物毒性最大，控制食品中組胺和酪胺的形成是酒類食品的重要安全問題[3]。釀酒過程中原料所含游離氨基酸、可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物以及適合該微生物生長(zhǎng)和氨基酸脫羧酶分泌的外界環(huán)境都會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的生物胺含量產(chǎn)生重要影響[4]。在酸性環(huán)境中，氨基脫羧酶活性提高，但產(chǎn)生氨基酸脫羧酶細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，所以pH值對(duì)生物胺含量的影響是pH值對(duì)氨基脫羧酶和產(chǎn)氨基酸脫羧酶細(xì)菌共同作用的結(jié)果[5]。溫度和酵母菌用量對(duì)產(chǎn)氨基酸脫羧酶有顯著影響[6-7]。

降低蜂蜜酒中生物胺的含量、提高蜂蜜酒的品質(zhì)和安全性具有重要意義。本試驗(yàn)通過考察蜂蜜酒釀造中的幾個(gè)關(guān)鍵因子對(duì)組胺和酪胺形成的影響，確定不同工藝條件與組胺和酪胺形成的關(guān)系，以優(yōu)化工藝條件來(lái)實(shí)現(xiàn)控制蜂蜜酒中生物胺的目的，為蜂蜜酒的開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜(嘉興市泌蜜園蜂產(chǎn)品有限公司)；帝伯仕果膠酶(食品級(jí)果膠酶，法國(guó)進(jìn)口)；釀酒高活性干酵母(安琪酵母)；檸檬酸和磷酸氫二胺為市售食品級(jí)。高氯酸、1，7-二氨基庚烷、丹磺酰氯、NaHCO3、氨水、乙醚均為分析純；乙腈、丙酮為色譜純。

VBR90 A手持糖度計(jì)(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，UB-7 pH計(jì)(美國(guó)丹佛公司)，戴安U-3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜酒的釀造

蜂蜜與水混合均勻→調(diào)節(jié)糖度→蜂蜜水滅菌(80 ℃)→添加果膠酶(50 ℃)→取干酵母活化(40 ℃)→添加活化的酵母(30 ℃)→裝瓶進(jìn)行蜂蜜酒釀造。

根據(jù)前期研究，試驗(yàn)過程將對(duì)溫度、糖度、pH值、酵母用量等幾個(gè)因子進(jìn)行比較，確定其對(duì)蜂蜜酒釀造過程中的組胺和酪胺形成的影響。

1.2.2 生物胺含量的測(cè)定[8]

樣品的衍生。取1 mL待測(cè)酒樣于15 mL離心管中，加20 mg·L-11，7-二氨基庚烷內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加入0.2 mL 2 mol·L-1NaOH溶液使之呈堿性，再加入0.3 mL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后加入10 mg·mL-1DNS-Cl溶液2 mL進(jìn)行柱前衍生，在40 ℃水浴黑暗反應(yīng)45 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.1 mL氨水終止反應(yīng)，靜置30 min。

萃取。加入3 mL乙醚于以上試樣中，再加入適量NaCl，振蕩分層后抽取上層液體于15 mL離心管中，重復(fù)3次，將3次取出的上層液體合并于小燒瓶中，加入適量無(wú)水硫酸鈉。在100 r·min-1的R-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，蒸干得固體顆粒。取下小燒瓶，加入1 mL乙腈振蕩清洗，倒出清洗液體，重復(fù)3次，合并液體，過0.22 μm微孔濾膜，濾液可直接進(jìn)HPLC測(cè)定。

高效液相色譜分析。采用戴安U-3000高效液相色譜儀，其中色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm內(nèi)徑，5 μm，Acclaim 120)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫30 ℃，流動(dòng)相B為超純水，C為乙腈溶液，流速1.0 mL·min-1，時(shí)間控制在30 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜的洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 釀造溫度對(duì)蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

釀造溫度對(duì)蜂蜜酒的品質(zhì)有重要的影響，一般釀造溫度在18～25 ℃。圖1～2可以看出，隨著釀造溫度的升高，蜂蜜酒中組胺和酪胺的含量顯著增加，溫度越高則增加越多?？赡苁轻勗鞙囟仍礁撸湍讣捌渌⑸镌邗惨褐械纳L(zhǎng)代謝速度越快的原因。在第7天時(shí)，釀造溫度為22 ℃和24 ℃條件下的組胺含量明顯高于其他溫度，同時(shí)發(fā)酵溫度越高，酵母的自溶速度也快，引起發(fā)酵液中氨基酸含量升高。酒液中組胺的終濃度受溫度的影響并不顯著，而酪胺的終濃度受釀造溫度的影響非常明顯。24 ℃時(shí)的酪胺濃度高達(dá)11.23 mg·L-1，是18 ℃時(shí)酪胺濃度(5.55 mg·L-1)的2倍。可見采用低溫釀造有利于控制蜂蜜酒中組胺和酪胺的形成。

圖1 溫度對(duì)蜂蜜中組胺形成的影響

圖2 溫度對(duì)蜂蜜中酪胺形成的影響

2.2 糖度對(duì)蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

蜂蜜酒釀造過程中的主要營(yíng)養(yǎng)物來(lái)源于添加的蜂蜜，通過控制蜂蜜的用量，調(diào)整蜂蜜酒釀造中醪液的糖度和其他營(yíng)養(yǎng)物的濃度。蜂蜜用量過低，所生產(chǎn)的蜂蜜酒酒體單薄，因而適量蜂蜜用量是蜂蜜酒品質(zhì)的關(guān)鍵控制因素之一[9]。

圖3～4表明，糖度對(duì)蜂蜜酒中組胺和酪胺的形成有顯著影響，當(dāng)醪液的糖度為30%(Brix)時(shí)，組胺和酪胺含量高達(dá)3.48和13.01 mg·L-1，分別為低糖度(21%)時(shí)的2.8和2.0倍。因此，綜合平衡蜂蜜酒的口感和生物胺含量，選擇適當(dāng)濃度的糖度對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。

圖3 糖度對(duì)蜂蜜中組胺形成的影響

圖4 糖度對(duì)蜂蜜中酪胺形成的影響

2.3 pH值對(duì)蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

pH值是影響食品中生物胺生成重要的發(fā)酵條件。酸性環(huán)境有利于氨基脫羧酶活性的提高，但會(huì)抑制產(chǎn)氨基酸脫羧酶細(xì)菌的生長(zhǎng)，pH值對(duì)生物胺含量的影響是對(duì)氨基脫羧酶和產(chǎn)氨基酸脫羧酶細(xì)菌共同作用的結(jié)果[10]。

圖5～6表明，從所考察的pH值(3.3～3.9)對(duì)組胺和酪胺形成的影響來(lái)看，低pH時(shí)，組胺和酪胺含量高；高pH值時(shí)，組胺和酪胺含量低。醪液起始pH值3.0時(shí)，組胺和酪胺的最高值均超過起始pH值3.9的2倍，但醪液起始pH值超過3.5時(shí)，通常會(huì)有發(fā)酵污染的危險(xiǎn)；pH值3.0的醪液對(duì)雜菌的生長(zhǎng)有抑制作用，采用高pH值生產(chǎn)工藝時(shí)，需保證良好的生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生。

圖5 pH值對(duì)蜂蜜中組胺形成的影響

圖6 pH值對(duì)蜂蜜中酪胺形成的影響

2.4 酵母用量對(duì)蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

酵母在酒精發(fā)酵過程中會(huì)改變蜂蜜水中含氮化合物的組成，可利用某些氨基酸，也能通過酵母的自溶作用釋放一些氨基酸，被乳酸菌等具有氨基酸脫羧酶活性的微生物利用生產(chǎn)生物胺。增加酵母菌的使用量會(huì)加快酒精發(fā)酵速度，縮短釀造時(shí)間，但酵母菌也會(huì)產(chǎn)生更多的氨基酸，增加生物胺產(chǎn)生的危險(xiǎn)性。

由圖7～8可知，不同酵母菌用量的蜂蜜酒中組胺和酪胺生成量有顯著區(qū)別。當(dāng)酵母用量為0.20%時(shí)，酒中組胺的量明顯比其他處理要高；當(dāng)酵母用量達(dá)到0.25%時(shí)，組胺的量又顯著下降。在考察的酵母用量范圍內(nèi)，隨著酵母用量的增加，酪胺的含量同步增加。當(dāng)酵母用量為0.25%時(shí)，酪胺含量為13.23 mg·L-1；而酵母用量為0.10%時(shí)，酪胺含量只有8.32 mg·L-1。

圖7 酵母用量對(duì)蜂蜜酒中組胺形成的影響

圖8 酵母用量對(duì)蜂蜜酒中酪胺形成的影響

3 小結(jié)

通過單因素分析法研究了蜂蜜酒生產(chǎn)過程中溫度、糖度、pH值、酵母量等主要工藝參數(shù)對(duì)組胺和酪胺產(chǎn)生量的影響。不同處理?xiàng)l件下的結(jié)果表明，起始階段組胺的含量先高后低，可能是因?yàn)榫w生長(zhǎng)旺盛，代謝速度過快造成的。而釀造28 d后，蜂蜜酒中的組胺和酪胺的含量趨于穩(wěn)定，增量不明顯，可能是因?yàn)獒勗旌笃诘臓I(yíng)養(yǎng)物消耗和酒精度過高的雙重作用使酒液中的生物轉(zhuǎn)化作用變?nèi)?，氨基酸脫羧酶的活力受到?yán)重影響造成的。不同處理?xiàng)l件下的組胺和酪胺的變化趨勢(shì)并不完全相同，表明蜂蜜酒釀造過程中組胺和酪胺產(chǎn)生的機(jī)理有所不同。研究結(jié)果表明，不同蜂蜜酒釀造工藝會(huì)導(dǎo)致組胺和酪胺產(chǎn)生量的不同。當(dāng)醪液起始pH值較高、酵母用量較少、糖度和釀造溫度均較低時(shí)，組胺和酪胺的含量處于較低水平。