盧佳琦 李市場 劉永康 馮騰柱 王大紅

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心/ 河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

低能離子束修飾技術(shù)作為一種有效的物理誘變方法，目前已在農(nóng)作物、植物和微生物等育種中得到廣泛繁應(yīng)用，并取得了良好的誘變效果[1-4]。不同于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法，低能離子束技術(shù)在誘變過程中因其具有突變率高、突變譜廣、損傷輕、易穩(wěn)定等優(yōu)點，已得到廣泛認(rèn)可[5-8]。

普魯蘭酶對支鏈淀粉中的α-1,6糖苷鍵具有專一性，能夠?qū)⒅ф湹矸壑械乃兄ф溔壳袛?，最終形成直鏈淀粉的一類脫支酶，在淀粉加工生產(chǎn)過程中具有一定的實用價值[9]。目前，國外普魯蘭酶的商業(yè)市場已被NOVO公司壟斷，雖然國內(nèi)有諾維信和杰能科等公司生產(chǎn)普魯蘭酶，但生產(chǎn)成本高，酶活不穩(wěn)定且酶活產(chǎn)量與國外有較大的差異[10-12]，因此選育普魯蘭酶高產(chǎn)菌仍是人們廣泛關(guān)注的問題。王新[13]通過紫外誘變、紫外-氯化鋰復(fù)合誘變及硫酸二乙酯對假交替單胞菌M25進(jìn)行處理得到一株普魯蘭酶產(chǎn)生菌；謝能中等[14]通過PCR法得到普魯蘭酶完整的編碼基因，為構(gòu)建基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。但利用低能離子束修飾技術(shù)誘變選育普魯蘭酶產(chǎn)生菌的研究尚鮮見報道。本研究利用低能離子束修飾技術(shù)對普魯蘭酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行誘變處理，進(jìn)而選育出一株普魯蘭酶產(chǎn)酶酶活高的菌株，然后通過響應(yīng)面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化并對其發(fā)酵特性進(jìn)行初步研究，旨在為利用低能離子束技術(shù)誘變普魯蘭酶產(chǎn)生菌的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

普魯蘭酶產(chǎn)生菌出發(fā)菌株GX-6，由河南仰韶生化工程有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉25 g·L-1、蛋白胨 10 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1、 KH2PO41 g·L-1、 MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉 55 g·L-1、黃豆餅粉 25 g·L-1、(NH4)2SO45 g·L-1、麥芽糖 12.5 g·L-1、吐溫-80 1mL·L-1、KH2PO410 g·L-1、 MgSO4·7H2O 5 g·L-1、FeSO41 g·L-1、CaCO33 g·L-1，pH值7.0。

鑒別培養(yǎng)基：普魯蘭糖 3 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO40. 5 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，pH值7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 離子束誘變處理 將斜面保藏的菌株GX-6用無菌水洗脫，置于無菌并存有玻璃珠的三角瓶中，180 r·min-1恒溫振蕩搖床振蕩2 h，使孢子活化、分散。然后用移液槍吸取0.1 mL菌懸液分別于5個無菌空平皿中，以無菌風(fēng)吹干，應(yīng)用5×1014、1×1015、5×1015、1×1016、5×1016ions·cm-25個劑量分別進(jìn)行離子束誘變，誘變時間分別為19、38、189、378、1 690 s，以未經(jīng)誘變組為對照，各劑量的處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2 突變菌株的挑選方法 經(jīng)離子束誘變后的平皿用無菌生理鹽水洗脫，稀釋涂布于鑒別培養(yǎng)基(對照組為未誘變菌株)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。然后以平板計數(shù)法計算菌株的存活率和突變率，測定菌株液體搖瓶發(fā)酵后的酶活。

1.3.3 突變菌株存活率及突變率的計算

存活率=各誘變單菌落數(shù)/未經(jīng)誘變單菌落數(shù)×100%

(1)

對離子注入后的菌株進(jìn)行篩選時，突變菌株的酶活力大于對照組5%的突變株稱為正突變，小于5%的菌株稱為負(fù)突變，在±5%之間表示未突變[15]。

突變率=A/B×100%

(2)

式中，A為突變菌株酶活值高于/低于對照組5%的菌落數(shù)，B為誘變菌株總菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子束誘變對菌株存活率的影響

在離子注入過程中，菌株會發(fā)生突變，甚至死亡。由圖1可知，隨著誘變劑量的增加，菌株的存活率曲線呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)誘變劑量在5×1014～5×1015ions·cm-2之間時，菌株存活率的下降較緩慢；當(dāng)誘變劑量為5×1015～5×1016ions·cm-2時，菌株存活率急劇下降，這可能是誘變劑量過大或者誘變梯度過少造成的。此外，低劑量的離子束誘變僅能破壞細(xì)胞的表面，所以存活率較高；隨著誘變劑量的增加，離子束注入過程中會產(chǎn)生大量的自由基，對細(xì)胞表面造成損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致菌株存活率呈下降的趨勢。

圖1 不同誘變劑量對菌株存活率的影響Fig.1 Effect of different mutation dose on survival rate of strain

2.2 離子束誘變對菌株突變率的影響

由圖2可知，當(dāng)誘變劑量分別為5×1014、1×1015、1×1016ions·cm-2時，菌株正突變率比負(fù)突變率高，且當(dāng)誘變劑量為1×1015ions·cm-2時，菌株的正突變率達(dá)到最大；當(dāng)誘變劑量分別為5×1015、5×1016ions·cm-2時，菌株的負(fù)突變率高于正突變率。在離子束誘變劑量選擇方面，應(yīng)考慮到突變菌株的正突變率和優(yōu)良菌株突變幅度的高低，以及菌株的篩選。因此，選擇1×1015ions·cm-2作為誘變劑量、誘變時間為38 s。在此誘變劑量下，利用離子束誘變技術(shù)反復(fù)誘變，最終獲得一株普魯蘭酶酶活較高的突變菌株GX-6-2，該突變菌株的酶活為2.13 U·mL-1，較出發(fā)菌株酶活(0.65 U·mL-1)提高了2.28倍。

2.3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗

本試驗將誘變菌株GX-6-2傳代8次，每代作3次平行試驗，其酶活值、均值及標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表1。利用DPS7.05軟件對表1進(jìn)行方差分析，通過對突變菌株遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行每代處理間(a)和每代處理內(nèi)(b)的變異(F)檢驗，以觀察其變異是否顯著，結(jié)果見表2。查F值表可得，F(xiàn)0.05(7,16)=2.66>F(7，16)=0.723 0，則P>0.05，說明突變菌株經(jīng)每次傳代后的遺傳穩(wěn)定性無顯著性差異，表明突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 1 The genetic stability experiment results of mutant strain

表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗方差分析表Table 2 The ANOVA of mutant strain in the experiment of genetic stability

Note:F0.05(7,16)=2.66.

注：每個誘變劑量下的菌株突變率是以隨機(jī) 挑取的100～200個單菌落統(tǒng)計的。Note: The mutation rate for each dose is based on a random sample of 100-200 colonies.圖2 不同誘變劑量對菌株突變率的影響Fig.2 Effect of different mutation dose on mutation rate of strain

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

運用Plackett-Burmen試驗設(shè)計從眾多考察因素中挑選顯著因子，然后結(jié)合Box-Behnken試驗對篩選出的重要因子進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化[16-18]，從而得到最佳的普魯蘭酶產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4.1 Plackett-Burmen試驗設(shè)計結(jié)果 Plackett-Burmen試驗設(shè)計被頻繁用于因子主效應(yīng)的篩選[19]。將普魯蘭酶產(chǎn)酶酶活作為響應(yīng)值，對玉米淀粉、黃豆餅粉、麥芽糖、吐溫-80、pH值、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速進(jìn)行篩選，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3、表4。

由表4可知，對普魯蘭酶酶活具有顯著影響的是玉米淀粉(P=0.003 5<0.01)、麥芽糖(P=0.007 2<0.01)、吐溫-80(P=0.001 5<0.01)，其他因素(黃豆餅粉、pH值、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速)不顯著。因此選取玉米淀粉、麥芽糖、吐溫-80作為下一步的響應(yīng)面優(yōu)化因子。

表3 Plackett-Burmen試驗設(shè)計與因素水平編碼表Table 3 Variables and levels of Plackett-Burmen experiment design

2.4.2 Box-Behnken試驗設(shè)計及方差分析 Box-Behnken試驗設(shè)計被廣泛用于分析試驗因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系研究[20-21]。以Plackett-Burmen挑選出的3個顯著因素(玉米淀粉A、麥芽糖B、吐溫-80 C)為自變量，以酶活值(Y)為響應(yīng)值。利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面因素水平設(shè)計見表5，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

經(jīng)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計分析可得到相應(yīng)的二次多項回歸模型方程：Y=1.88+0.24A+0.12B+0.018C+0.082AB-0.033AC-0.092BC-0.14A2-0.058B2+0.032C2，R2=0.962 4。由表7可知，該模型(P=0.000 3)極顯著；回歸系數(shù)R2=0.962 4，表明模型對實際情況擬合程度較好。模型(P=0.000 3)極顯著，失擬項(P=0.385 6> 0.1)不顯著，說明二次回歸模型選用正確，表明該回歸模型能夠較好地預(yù)測最優(yōu)的實際普魯蘭酶產(chǎn)生菌株的酶活。顯著性分析表明，因素A和B作用極顯著，而因素C作用不顯著；二次項A2作用極顯著，B2和C2作用不顯著；交互項AB和BC作用顯著，AC作用不顯著。

表4 Plackett-Burmen試驗設(shè)計結(jié)果Table 4 Results of Plackett-Burmen experiment design

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:**means extremely significant difference at 0.01 level.*means significant difference at 0.05 level. The same as following.

2.4.3 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)面圖的建立可直觀反映各因素及其交互作用與響應(yīng)值之間的關(guān)系。等高線的形狀可以反映兩因素交互作用的強(qiáng)弱，等高線形狀呈橢圓表明交互作用顯著，形狀越接近正圓形表示交互作用越不顯著[22-23]。各因素響應(yīng)面圖和等高線圖如圖3、圖4、圖5所示。

圖3反映了當(dāng)吐溫-80在中心水平時，玉米淀粉與麥芽糖對菌株酶活的交互影響。由等高線圖可知，玉米淀粉與麥芽糖交互作用顯著。當(dāng)玉米淀粉在45 ～ 55 g·L-1范圍內(nèi)時，菌株酶活隨著玉米淀粉量的增加呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)玉米淀粉在55 ～65 g·L-1范圍內(nèi)時，菌株酶活隨著玉米淀粉量的增加不斷下降。麥芽糖在10.5 ～12.5 g·L-1范圍內(nèi)時，菌株酶活與麥芽糖間呈遞增關(guān)系；而麥芽糖量為12.5～14.5 g·L-1范圍內(nèi)時，菌株酶活隨著麥芽糖量不斷增加而逐漸降低。由圖4、圖5可知，麥芽糖與吐溫-80有顯著的交互作用而玉米淀粉與吐溫-80交互作用不顯著。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與因素水平表Table 5 Variables and levels of response surface design

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳發(fā)酵參數(shù)為：玉米淀粉56.4 g·L-1、麥芽糖11.4 g·L-1、吐溫-80 0.93 mL。在該條件下，菌株的預(yù)期酶活最優(yōu)值為2.25 U·mL-1。

2.4.4 模型的驗證試驗 為了便于試驗操作，將上述優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行微小的修正，即玉米淀粉56.5 g·L-1、麥芽糖11.5 g·L-1、吐溫-80 1.0 mL·L-1，進(jìn)行驗證試驗。誘變菌株經(jīng)3次平行試驗測得酶活分別為2.30、3.00、2.41 U·mL-1，平均值為2.57 U·mL-1，與預(yù)期值2.25 U·mL-1非常接近。在響應(yīng)面優(yōu)化條件下，誘變菌株的酶活可達(dá)到2.57 U·mL-1，較出發(fā)菌株酶活提高了2.95倍。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 The design and results of Box- Behnken experiment

表7 模型的方差分析Table 7 ANOVA for the developed quadratic polynomial model

圖3 玉米淀粉與麥芽糖交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 Response surface and contour map of interaction between corn starch and maitose

圖4 麥芽糖與吐溫-80交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of interaction between maltose and Tween-80

圖5 玉米淀粉與吐溫-80交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of interaction between corn starch and Tween-80

2.5 突變菌株的發(fā)酵特性的研究

將經(jīng)誘變選育出的高產(chǎn)菌株在上述培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每隔2 h觀察一次，并取樣測酶活繪制發(fā)酵曲線，每組試驗平行3次，對普魯蘭酶高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行初步研究。由圖6可知，從發(fā)酵培養(yǎng)8 h開始，突變菌株酶活隨著發(fā)酵時間的延長呈上升趨勢，而到發(fā)酵培養(yǎng)26 h后突變菌株酶活有所下降，這可能是由于在發(fā)酵培養(yǎng)26 h時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分消耗殆盡，突變菌株發(fā)生自溶，引起發(fā)酵pH值和酶活逐漸降低，但整個發(fā)酵過程中突變菌株的酶活始終比出發(fā)菌株酶活高。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)24 h時，突變菌株酶活達(dá)到2.67 U·mL-1，較出發(fā)菌株提高了3.11倍。

圖6 突變株的發(fā)酵曲線Fig.6 The fermentation curve of mutant strain

3 討論

目前，國內(nèi)主要通過紫外線、微波誘變、原生質(zhì)體誘變或者是原生質(zhì)體與紫外線復(fù)合誘變等對普魯蘭酶產(chǎn)生菌進(jìn)行選育[24-26]。本研究利用低能離子束修飾技術(shù)誘變選育出一株高產(chǎn)普魯蘭酶菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘變能量為10 keV，誘變劑量為1×1015ions·cm-2時能獲得一株遺傳性穩(wěn)定的普魯蘭酶高產(chǎn)菌株。這是因為與傳統(tǒng)誘變方法相比，離子注入過程中不僅有能量沉積效應(yīng)，還具有動量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷中和與交換等效應(yīng)存在[27]。此外，離子注入引發(fā)的突變在低劑量注入時，細(xì)胞損傷較輕，可通過自身的酶修復(fù)系統(tǒng)恢復(fù)損傷，易獲得較高的突變率和較寬的突變譜，更能篩選到有利突變型菌株[28]。

響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉56.5 g·L-1、麥芽糖11.5 g·L-1、吐溫-80 1.0 mL·L-1、黃豆餅粉 25 g·L-1、(NH4)2SO45 g·L-1、KH2PO410 g·L-1、 MgSO4·7H2O 5 g·L-1、FeSO41 g·L-1、CaCO33 g·L-1。發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37℃，接種量3%、pH值7.0。菌株優(yōu)化后酶活可達(dá)到2.57 U·mL-1，較出發(fā)菌株酶活提高了2.95倍。該誘變條件下的菌株產(chǎn)酶酶活與甄杰等[29]和嚴(yán)偉等[30]報道的基因工程菌相去甚遠(yuǎn)，其表達(dá)后的重組普魯蘭酶分別為42 U·mL-1和10.8 U·mL-1。但在野生菌株中有一定的優(yōu)勢，如朱夢[31]和程景偉等[32]篩選得到的產(chǎn)普魯蘭酶菌株的酶活力分別為0.36 U·mL-1和0.63 U·mL-1。

4 結(jié)論

本研究對出發(fā)菌株GX-6進(jìn)行低能離子束誘變處理，選育得到普魯蘭酶高產(chǎn)菌株GX6-2，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，使酶活明顯得到了提高。本研究結(jié)果為利用低能離子束修飾技術(shù)誘變選育普魯蘭酶產(chǎn)生菌提供了一定的參考。