王潔 馬委委 司晨琛 周炳榮 駱丹

[摘要]目的：探討miR-4655-3p在中波紫外線旁觀者效應中的作用。方法：使用miR-4655-3p 抑制劑（inhibitor）或其對應的陰性對照（negative control，NC）轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞（HSFs）后，對不同組HSFs進行UVB（60mJ/cm2）單次照射，照光后24h取細胞培養(yǎng)上清液與正常HSFs共孵育48h，分別測定細胞增值率、氧化損傷水平及凋亡率。結果：inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞中miR-4655-3p相對表達量較NC轉(zhuǎn)染組明顯降低（P<0.05）;照光后，inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞、細胞培養(yǎng)上清液及該上清液孵育的HSFs中miR-4655-3p的相對表達量較NC轉(zhuǎn)染組顯著降低（P<0.05）;與NC組旁觀者細胞相比，Inhibitor組旁觀者細胞的增殖率增加，氧化損傷水平及凋亡率減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：miR-4655-3p在中波紫外線旁觀者效應中發(fā)揮作用，抑制其表達可在一定程度上減弱紫外線旁觀者效應。

[關鍵詞]miRNA;成纖維細胞;紫外線;旁觀者效應;氧化損傷;凋亡

[中圖分類號]R329.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）04-0068-03

Abstract： Objective? To investigate the role of miR-4655-3p in UVB-radiation induced bystander effects（UVB-RIBE）. Methods? HSFs transfected with miR-4655-3p inhibitor or NC were exposed to 60mJ/cm2 single UVB radiation. 24h after UVB radiation， the supernatant were transfered to normal HSFs and remained for 48h. Subsequently， cell proliferation rate， oxidative damage and apoptosis rate of recipient cells were measured. Results? The relative expression of miR-4655-3p in the inhibitor transfected cells were lower than the NC transfected cells. After UVB radiation， the relative expression of miR-4655-3p in the inhibitor transfected cells， their supernatant and the supernatant cultured bystander cells were lower than the corresponding NC transfected groups. The cell proliferation rate of bystander cells from inhibitor group was higher than bystander cells from NC group. Besides， the oxidative damage and apoptosis rate of bystander cells from inhibitor group was lower than bystander cells from NC group. All the data were statistically significant（P<0.05）. Conclusion? miR-4655-3p plays a role in UVB bystander effect. The down-regulation of miR-4655-3p inhibits UVB bystander effect to some extent.

Key words： miRNA; fibroblasts; ultraviolet; bystander effects; oxidative damage; apoptosis

日光紫外線是造成皮膚光老化的重要因素，長期暴露于紫外線下會引起皮膚中多種細胞結構及功能發(fā)生變化。目前認為紫外線旁觀者效應在紫外線不良反應的病理進展中發(fā)揮了重要作用。紫外線旁觀者效應是指未受輻射細胞發(fā)生與直接受輻射細胞類似的光損傷反應，包括氧化損傷、基因突變、基因組不穩(wěn)定，細胞凋亡等[1]。研究表明，旁觀者效應由細胞間間隙連接和分泌因子構成的細胞間通訊引起[2]。筆者先前的實驗通過使用基因芯片和實時定量PCR鑒定了中波紫外線輻射后差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-4655-3p在受照射的細胞、輻射細胞培養(yǎng)上清液中及其上清液培養(yǎng)的細胞中表達顯著升高。鑒于已有部分miRNA被證明在旁觀者效應中扮演著重要角色[3-4]，筆者推斷miR-4655-3p在紫外線旁觀者效應中發(fā)揮一定作用。本實驗通過使用miR-4655-3p抑制劑下調(diào)中波紫外線照射后miR-4655-3p的表達，進一步研究miR-4655-3p在紫外線輻射旁觀者效應中的作用。

1? 材料和方法

1.1 HSFs的分離與培養(yǎng)：取健康成年男性的包皮組織，將包皮置于碘伏中浸泡6min。使用含10%青-鏈霉素的PBS溶液，快速反復沖洗包皮組織至無血跡，使用眼科剪仔細剪去皮下組織后加入適量0.25% Dispase酶消化液，并在4℃冰箱中消化18h。分離表、真皮組織后取真皮部分，加入適量0.1%膠原酶I消化液，并在37℃培養(yǎng)箱中消化2h。加入等量含10%胎牛血清（杭州四季青公司）及1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）終止反應。使用200目尼龍網(wǎng)過濾，過濾液在1 500rpm下離心5min，棄上清，加入全培并輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞處理：HSFs于處理前1d以50%的密度均勻種植于6孔板中。轉(zhuǎn)染試劑、miR-4655-3p inhibitor及inhibitor陰性對照購于廣州銳博生物科技有限公司，根據(jù)說明書配制100nM的轉(zhuǎn)染混合液，并在室溫下放置10min。小心將轉(zhuǎn)染混合液滴入細胞培養(yǎng)上清中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后刷新培養(yǎng)基并對細胞進行單次60mJ/cm2 UVB照射，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將此細胞培養(yǎng)上清加入正常HSFs中培養(yǎng)48h。

1.3 實時定量PCR：使用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA。用莖環(huán)法進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，U6作為miRNA的內(nèi)參。使用TB Green嵌合熒光試劑（日本TaKaRa公司）進行實時定量PCR反應。PCR程序使用StepOnePlusTM實時PCR系統(tǒng)，用2-△△Ct值比較分析數(shù)據(jù)。

1.4 細胞增殖率測定：96孔板中的細胞用轉(zhuǎn)染細胞上清培養(yǎng)48h后，去除上清并用PBS清洗3遍。每孔中加入100?l培養(yǎng)基與10?l CCK8溶液（日本Dojindo公司）并混勻。在培養(yǎng)箱中避光孵育1.5h后使用酶標儀測定450nm處的吸光度。

1.5 氧化損傷水平測定：6孔板中的細胞用轉(zhuǎn)染細胞上清培養(yǎng)48h后，去除上清并用PBS清洗3遍。按照1：500的比例用裸培稀釋DCFH-DA（上海碧云天生物技術有限公司），每孔中加入1ml混合液，于培養(yǎng)箱中避光孵育20min。用裸培洗滌3次后使用熒光顯微鏡觀察，或收集細胞后使用流式細胞儀檢測DCF熒光強度。

1.6 細胞凋亡率檢測：6孔板中的細胞用轉(zhuǎn)染細胞上清培養(yǎng)48h后，去除細胞上清并用PBS清洗3遍。收集細胞用200?l緩沖液重懸，加入3?l Annexin V-FITC及3?l PI后輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育10min后，使用流式細胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗重復至少3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x?±s）表示，行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 inhibitor轉(zhuǎn)染下調(diào)UVB照射后miR-4655-3p的表達：inhibitor轉(zhuǎn)染細胞miR-4655-3p相對表達量（0.5279±0.031）顯著低于NC轉(zhuǎn)染組（1.0±0.1）;細胞轉(zhuǎn)染后照光并培養(yǎng)24h后，inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞中（0.4400±0.079）及上清液中（0.3295±0.044）miR-4655-3p的相對表達量較NC轉(zhuǎn)染組（1.0±0.1）顯著降低;inhibitor轉(zhuǎn)染組上清液培養(yǎng)48h后，旁觀者細胞中miR-4655-3p的相對表達量（0.5664±0.072）較NC組上清液培養(yǎng)的旁觀者細胞（1.0±0.1）顯著降低。以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 miR-4655-3p的下調(diào)對旁觀者細胞增殖率的影響：使用OD值表示細胞增殖水平，inhibitor組旁觀者細胞的增殖率（0.8697±0.016）高于NC組旁觀者細胞（0.7911±0.012），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 miR-4655-3p的下調(diào)對旁觀者細胞氧化損傷水平的影響：使用熒光顯微鏡觀察，可見inhibitor組旁觀者細胞的熒光亮度低于NC組旁觀者細胞。使用流式細胞儀檢測DCF平均熒光強度，inhibitor組旁觀者細胞的熒光強度（112.5±13.44）顯著低于NC組旁觀者細胞（171.9±7.38），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 miR-4655-3p的下調(diào)對旁觀者細胞凋亡水平的影響：流式細胞儀檢測細胞凋亡率，inhibitor組旁觀者細胞的凋亡率（14.82±2.54）較NC組旁觀者細胞（27.70±1.97）減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3? 討論

旁觀者效應是一種已經(jīng)被充分證明的現(xiàn)象，其中由輻射引起的部分稱為輻射誘導的旁觀者效應。目前研究證明，輻射誘導的旁觀者效應由輻射細胞與旁觀者細胞之間的細胞間通訊引起，這種通信方式包括細胞間連接及可溶性因子等。

miRNA是一種長約22個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)結合調(diào)節(jié)其表達[5]。據(jù)報道，miRNA可參與許多生理和病理過程，包括細胞周期、免疫反應、生物代謝，致癌作用等[6]。最近，miRNA已被證明是參與旁觀者效應的潛在介質(zhì)[3-4]。Tian等[7]人研究認為miR-21通過調(diào)節(jié)SOD2促進了α照射的HaCaT角質(zhì)形成細胞誘導的旁觀者效應。然而Hu等[8]人證實miR-663通過反饋模式靶向TGF-β1抑制輻射誘導的旁觀者效應。這些研究暗示miRNA在旁觀者效應中發(fā)揮作用，且這些作用是多方面的，需要進一步研究單個miRNA在旁觀者效應中的功能及其作用于旁觀者細胞的途徑。作為RNA的一種，miRNA易被RNA酶降解，細胞外miRNA通過結合高密度脂蛋白[9]，與Ago2形成蛋白質(zhì)復合物[10]或被包裝到細胞外囊泡中[11]而避免被降解，這些miRNA統(tǒng)稱為分泌型miRNA。其中，由于具有特異性轉(zhuǎn)運到靶細胞的能力，外泌體miRNA的功能得到了很多關注。已經(jīng)報道了其在多方面的功能，例如參與腫瘤的發(fā)生[12]，在疾病中發(fā)揮促進或保護作用[13-14]并充當臨床生物標志物[15]。

本課題組前期實驗使用基因芯片篩選出了許多中波紫外線輻射細胞中差異表達的miRNA。通過進一步檢測輻射細胞培養(yǎng)上清液中miRNA表達，發(fā)現(xiàn)了一些與輻射細胞中呈現(xiàn)相同表達趨勢的miRNA，其中miR-4655-3p表達顯著增高。使用輻射細胞培養(yǎng)上清液孵育正常HSFs，出現(xiàn)類似直接受輻射細胞的光損傷效應，說明這些上清液中有引起旁觀者效應的介質(zhì)。結合既往關于miRNA及旁觀者效應間的研究，筆者推測miR-4655-3p是起作用的介質(zhì)之一。本實驗使用inhibitor下調(diào)UVB輻射后的miR-4655-3p表達，發(fā)現(xiàn)抑制miR-4655-3p后，旁觀者細胞的光損傷效應在一定程度上減弱。這些結果表明UVB輻射過后，miR-4655-3p的升高促進了紫外線旁觀者效應。

本文雖然證明了miR-4655-3p在旁觀者效應中起促進作用，但不足之處在于并未闡明miR-4655-3p在細胞間轉(zhuǎn)移的具體機制及其引起旁觀者效應的分子機理。同時，有研究強調(diào)了miRNA之間的相互作用[16]，這不禁讓筆者思考，紫外線旁觀者效應的機制中是否也存在類似作用，這些問題都有待于進一步的研究及探討。隨著對miRNA和紫外線旁觀者效應的進一步了解，這些研究可能為紫外線防護和紫外線相關疾病的治療提供新的見解。

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[收稿日期]2019-01-05