李瑞，張耀東，趙鼎，孫紅啟，楊俊梅，李進香

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院；河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室；鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州450018)

胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor，IGF-1）也被稱作“生長介素”，是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽，由肝臟和其它多種組織所分泌[1]，近年來很多研究表明[2-4]，IGF-1是聯(lián)系營養(yǎng)和生殖的紐帶，是青春發(fā)育啟動的重要信號之一。在嬰兒的生長和在成人體內(nèi)持續(xù)進行合成代謝作用上具有重要意義。臨床上已作為常規(guī)檢測指標(biāo)判斷兒童骨骼生長狀況。

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法是檢測該項目的一種敏感、特異的快速檢測方法。根據(jù)美國臨床實驗室改進修正案和ISO15189等文件對實驗室質(zhì)量的管理要求和實驗室認可的要求[5，6]，檢測系統(tǒng)在用于臨床之前必須對其分析性能進行驗證。本研究通過AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)測定IGF-1的分析靈敏度、分析內(nèi)精密度、分析間精密度、線性范圍、回收實驗和參考區(qū)間，以驗證廠商給定的性能參數(shù)，為臨床應(yīng)用該項目提供準確、詳實、可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集我院2017年11月-12月就診患兒的新鮮血清標(biāo)本，按照要求分為高、低濃度，冰箱-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑 全自動化學(xué)發(fā)光測定儀（AutoLumo A2000），胰島素樣生長因子-1檢測試劑盒（豫械注準20152400476）

1.3 方法

1.3.1 分析靈敏度 將試劑盒中零濃度校準品（S0）重復(fù)測定10次，得出10次測量結(jié)果的RLU值（相對發(fā)光值），計算其平均值（M）和標(biāo)準差（SD），得出M+2SD的RLU值，將M+2SD帶入lin-log擬合的標(biāo)準曲線方程中，求出對應(yīng)的濃度值，即為分析靈敏度。

1.3.2 分析內(nèi)精密度 按照CLSI EP5-A2文件要求[7]，選擇安圖公司配套的高、低值質(zhì)控品（批號：2017081601）作為精密度評價的樣本進行檢測，1d內(nèi)連續(xù)測定10次，分別計算均值（x），標(biāo)準差（S）和變異系數(shù)（CV）。

1.3.3 分析間精密度 將上述兩種濃度的混合血清每天測定5次，連續(xù)測定3d，分別計算均值（x），標(biāo)準差（S）和變異系數(shù)（CV）。

1.3.4 線性范圍 按照CLSI EP6-A2文件要求[8]，取 IGF-1高值（H）和低值（L）血清各 1份，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L 和 5L 稀釋，形成系列濃度血清進行測定，以稀釋后的理論值為X，實測值為Y，將所有結(jié)果標(biāo)在坐標(biāo)圖上，計算回歸方程：Y=bX+a驗證線性范圍，判斷標(biāo)準為b值在0.97～1.03 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù) R2≥0.9900。

1.3.5 回收實驗 將高值混合樣本A（濃度為535.6745ng/ml）加入到低值混合樣本B（濃度為51.8905ng/ml）中，樣本A與樣本B的體積比例為1：4，配置成樣本 C（濃度為 105.983ng/ml），分別測量樣本A、B和C，各重復(fù)2次，計算平均值作為檢測值，比較實際檢測值和理論值的差異，計算回收率R，回收率應(yīng)在80～100%范圍內(nèi)。

1.3.6 干擾實驗 按照CLSI EP7-P文件要求[9]，⑴溶血干擾物：取新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加蒸餾水配制，血紅蛋白(Hb)濃度分別為5、3、l g/L；⑵三酰甘油(TG)干擾物：取高血脂患者樣本加蒸餾水配制，TG濃度分別為12、6、3mmol/L；⑶膽紅素干擾物：取黃疸患者樣本加蒸餾水配制，總膽紅素(TBil)濃度分別為 150、100、50umol/L；⑷計算：低水平樣本和高水平樣本各分成2份，每份樣本重復(fù)測定5次計算分析干擾值：干擾值=T-C，即各組均值-未加干擾物相應(yīng)組的均值。干擾值在對照組1.96s(95%可信區(qū)間)范圍內(nèi)為無顯著干擾。

1.3.7 參考區(qū)間 選擇在線性范圍內(nèi)的高值樣本1份，用系統(tǒng)稀釋液按照說明書最大稀釋倍數(shù)5倍進行稀釋，測定原高值樣本和稀釋后樣本各2次，得出靶值(原值均值)和測定值（稀釋后樣本均值M×5），計算檢測值與靶值的相對偏倚（%）。偏倚=[（測定值-靶值）/靶值]×100%。

2 結(jié)果

2.1 分析靈敏度驗證結(jié)果 10次S0發(fā)光值均值為178788，SD 為 54025，均值+2SD 為 286838，得出最低檢測限即分析靈敏度為5.81ng/ml。

2.2 精密度驗證結(jié)果 分析內(nèi)精密度驗證結(jié)果為低、高值樣品（CV%）分別為6.31%和5.65%；分析間精密度驗證結(jié)果為低、高值樣品（CV%）分別為6.46%和8.09%。均小于廠商提供的數(shù)據(jù) （不大于10%）。見表1。

2.3 線性范圍驗證結(jié)果 選取IGF-1高濃度（839.653ng/ml）和低濃度（54.548ng/ml）血清，稀釋后的理論值和實測均值見表2，散點圖見圖1，結(jié)果顯示 Y=1.027X-50.77，R2=0.9929。 b=1.027 在0.97～1.03 范圍內(nèi)，R2≥0.9900， 故 IGF-1 濃度在15～1000ng/ml范圍內(nèi)線性良好。

表1 精密度實驗驗證結(jié)果（ng/ml）

表2 線性范圍驗證（ng/ml）

2.4 回收實驗驗證結(jié)果 將高低值血清樣本按比例混合后上機檢測，根據(jù)檢測值和理論值計算回收率R為105.70%，見表3。

表3 回收率驗證（ng/ml）

2.5 干擾實驗驗證結(jié)果 TBil濃度高達150umol/L、TG濃度高達12mmol/L時，測定的IGF-1高、低水平樣本的干擾值均在干擾限度值 （1.96s）范圍內(nèi)，均不構(gòu)成干擾。而Hb低于5g/L時使IGF-l的濃度明顯下降。

圖1 IGF-1線性分析

2.6 參考區(qū)間驗證結(jié)果 原值兩次測定結(jié)果均值為737.5645ng/ml稀釋樣本兩次測定結(jié)果均值為140.8105ng/ml，偏差為-4.54%，符合標(biāo)準要求：偏差不大于±20%，試劑盒參考范圍可滿足15～5000ng/ml的要求。

3 討論

IGF是一類既有胰島素樣合成代謝作用，又有促生長作用的單鏈多肽，血中90%的IGF-1由肝臟合成。目前發(fā)現(xiàn)，IGF有IGF-1和IGF-2兩種。IGF-1是GH依賴的生長因子，IGF-1作為一個重要的有絲分裂原，在機體中的主要作用是促進細胞的生長分化，而IGF-2是重要的胚胎生長和發(fā)育調(diào)節(jié)因子，GH的大部分生物學(xué)效應(yīng)是由肝、腎等組織依賴所產(chǎn)生的IGF-1介導(dǎo)[10，11]。生后隨年齡的增長，IGF-1水平緩慢升高，直到青春發(fā)育前大致與成人相似，青春發(fā)育期IGF-1水平急劇升高，為成人水平2倍以上，持續(xù)幾年后下降，18歲以后達成人水平，50歲后呈緩慢下降的趨勢[12，13]。因此，臨床工作中常常用血清IGF-1水平來協(xié)助診斷生長激素缺乏癥，或?qū)κ褂蒙L激素治療的兒童進行用藥的安全監(jiān)測和療效評估。

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測IGF-1的原理是采用雙抗體夾心法。用抗人IGF-1抗體包被于酶標(biāo)板上，實驗時標(biāo)本或標(biāo)準品中的IGF-1會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IGF-1抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素?？谷薎GF-1抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IGF-1結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過氧化物酶的催化下發(fā)出熒光，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定化學(xué)發(fā)光值（RLU），IGF-1濃度與化學(xué)發(fā)光值之間呈正相關(guān)，通過繪制標(biāo)準曲線求出標(biāo)本中IGF-1的濃度。

任何分析方法都存在一定的誤差，為保證高質(zhì)量的臨床實驗室服務(wù)，對選定的方法經(jīng)過初步試驗之后或用于臨床常規(guī)檢測之前以及在對原有檢測系統(tǒng)進行修改后，實驗室須對該方法進行嚴格、系統(tǒng)的技術(shù)性能評價或?qū)S家所提供的技術(shù)性能指標(biāo)進行驗證[14]。美國病理家學(xué)會(CAP)要求申請認可的實驗室在開展新檢測項目前，需要根據(jù)本實驗室條件對廠家提供的性能參數(shù)進行驗證方可使用[15]，為此CLSI出臺了一系列EP指南文件，本研究根據(jù)相應(yīng)的EP文件進行評價，EP5-A2為定量測量方法的精密度性能評價方案，是目前評價測量方法精密度最全面、最具統(tǒng)計學(xué)效能的方法；EP7-A2為臨床化學(xué)干擾試驗-批準指南，其干擾篩選方案是目前較為常用的方法；EP6-A2為定量測量方法的線性評價方案是多項式評價方法中具有代表性的方法[16]。方法學(xué)驗證最重要的指標(biāo)是準確度和精密度。本研究通過回收實驗驗證準確度，計算平均回收率R為105.70%，符合標(biāo)準要求。本實驗中黃疸和脂血抗干擾能力較強，而溶血狀態(tài)抗干擾能力較弱，建議在臨床報告結(jié)果中注明標(biāo)本存在的可能干擾因素，提醒臨床注意。精密度是檢測系統(tǒng)的主要分析性能之一，更是其他性能評價的基礎(chǔ)。精密度是體現(xiàn)重復(fù)性的重要性能指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定IGF-1的低、高值混合血清分析內(nèi)精密度CV分別為6.31%和5.65%，分析間精密度CV分別為6.46%和8.09%，均符合標(biāo)準要求：不大于15%。線性范圍驗證的目的是驗證該方法的最高檢測值和高、低檢測值之間是否呈線性關(guān)系，其評價有助于發(fā)現(xiàn)儀器、校準品、試劑和操作規(guī)程等方面的誤差來源，本研究通過系列比例稀釋，檢測IGF-1水平，驗證對數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，通過目測圖1可看出多項式的擬合曲線近為重合，所有數(shù)據(jù)幾乎均落在一條直線上，初步判斷最佳的擬合形式為直線，且數(shù)據(jù)的精密度較高，證實在該濃度范圍內(nèi)稀釋的幾個點為直線方程，結(jié)果表明實測濃度與理論濃度之間相關(guān)性良好，R2為0.9929。

綜上所述，通過對IGF-1的分析靈敏度、分析精密度、線性范圍、回收率、干擾實驗和參考范圍的評價和分析，證實AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)應(yīng)用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)測定IGF-1的靈敏度高、精密度好、結(jié)果準確可靠，性能可滿足臨床檢測的要求。