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        南昌地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者DEL型檢測(cè)及分析

        2019-04-15 06:57:20張瑩瑩余真強(qiáng)熊建平陳火玲杜忻徐晶
        關(guān)鍵詞:獻(xiàn)血者南昌表型

        張瑩瑩,余真強(qiáng),熊建平,陳火玲,杜忻,徐晶

        (南昌市中心血站,江西 南昌330025)

        DEL型作為RhD血型中的一種特殊變異體,其輸血安全性一直存在爭(zhēng)議。已有研究學(xué)者提出將DEL型從RhD陰性獻(xiàn)血者中篩選出來(lái),避免產(chǎn)生同種異體免疫[1,2]。在中國(guó),陰性人群中DEL型占有較高的比例,且遺傳學(xué)背景非常復(fù)雜,DEL型的準(zhǔn)確鑒定對(duì)確保陰性患者的臨床輸血安全具有重要的指導(dǎo)意義[3-5]。為調(diào)查南昌地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者中DEL表型分布以及與各地DEL型表型分布進(jìn)行比較,本課題應(yīng)用酸吸收放散及PCR-SSP實(shí)驗(yàn)方法從RhD陰性獻(xiàn)血者中篩查DEL表型并進(jìn)行基因分型,為制定南昌地區(qū)DEL型輸血策略提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 樣本來(lái)源 2017年2月至2018年1月南昌市中心血站RhD陰性獻(xiàn)血者樣本,共計(jì)107例。

        1.2 試劑與儀器 抗-A、抗-B試劑、ABO紅細(xì)胞、抗體篩選細(xì)胞 (上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司);抗-AB 試劑(法國(guó) DIAGAST);凝聚胺試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司);IgM型單克隆抗-D試劑、IgG型單克隆抗-D試劑 (上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司);IgM+IgG型單克隆抗-D試劑(英國(guó)Millipore(UK)Ltd);人源抗-D 血清(我站自制,抗體效價(jià)>256);抗-C、抗-c、抗-E、抗-e 單克隆抗體檢測(cè)試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司);酸吸收放散試劑(廣州展全生物科技有限公司);引物、DNA 提取試劑盒(Innotrain);Taq 酶(Promega);久保田離心機(jī)(KA-2002);GRIFOLS 離心機(jī)(DGTherm);GRIFOLS 孵 育 器 (DGSpin);PCR 擴(kuò) 增 儀(SimpliAmp);凝膠成像儀(G:BOX F3)。

        1.3 方法

        1.3.1 RhD陰性確認(rèn) 對(duì)鹽水法初篩為RhD陰性的樣本用抗人球蛋白法確認(rèn),并進(jìn)行C、c、E、e抗原分型。

        1.3.2 酸吸收放散 將確認(rèn)為RhD陰性的樣本取200μl紅細(xì)胞,洗滌3次制成壓積紅細(xì)胞,加入等體積人源-D,混合均勻,37℃水浴30min,洗滌6次制成壓積紅細(xì)胞,將等體積酸放散試劑加入吸收紅細(xì)胞,迅速混勻離心,3400r/min,離心1min,取放散液100μl,將pH調(diào)節(jié)劑滴入放散液調(diào)至中性,加入50μl O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞,37℃水浴1h,用微柱凝膠方法檢測(cè)放散結(jié)果。

        1.3.3 PCR-SSP 將酸吸收放散陽(yáng)性的 5 例 DEL 型樣本送至廣州血液中心,通過PCR-SSP方法進(jìn)行RhD基因檢測(cè)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 RhD陰性獻(xiàn)血者表型分布 107例RhD陰性獻(xiàn) 血 者 中 ccee 53 例 (49.53% ),Ccee 37 例(34.58% ),CCee 11 例 (10.28% ),CcEe 3 例(2.80%),ccEe 3 例(2.80%)。

        2.2 中國(guó)各地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者DEL型分布特征 107例陰性獻(xiàn)血者中檢出DEL型30例(28.04%),與上海地區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.02,P<0.05),與其它地區(qū)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表 1。

        表1 南昌與各地RhD陰性獻(xiàn)血者DEL型分布比較

        2.3 DEL型獻(xiàn)血者表型分布 檢出DEL型30例,占比為 28.04%,其中 Ccee 23 例(76.67%),CCee 7例(23.33%),與各地區(qū)DEL型獻(xiàn)血者表型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表 2。

        表2 南昌與各地DEL型獻(xiàn)血者表型分布比較

        2.4 PCR-SSP基因分型結(jié)果 5例DEL型標(biāo)本第9外顯子均有1227G>A突變,其中雜合子4例,純合子1例,見圖1。

        圖1 PCR-SSP基因分型結(jié)果

        3 討論

        RhD是繼ABO血型系統(tǒng)之后最重要的血型系統(tǒng),在臨床輸血、自身免疫性溶血以及新生兒溶血中有著重要意義[10-12]。DEL型作為特殊的RhD變異體,其重要性受到廣泛關(guān)注。本研究顯示,在南昌地區(qū)的107例RhD陰性獻(xiàn)血者中30例為DEL型,占 28.04%,除與上海(P<0.05)地區(qū)存在統(tǒng)計(jì)差異外,與其它地區(qū)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DEL型在南昌地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者中占比較高,因此深入研究DEL型對(duì)提高臨床輸血安全性具有重要意義。

        本研究的30例DEL型樣本中,RhCE表型主要為 Ccee(76.7%)和 CCee(23.3%),與浙江、上海、臺(tái)灣和福州的研究結(jié)果相似 (P>0.05),說(shuō)明DEL型與Ce單倍體關(guān)系密切,可能與RhD基因和RhCe 基因緊密連鎖有關(guān)[13-16]。

        對(duì)于RhD陽(yáng)性個(gè)體來(lái)說(shuō),至少擁有一條正常RHD基因,RhD陰性個(gè)體的主要分子機(jī)制在于RHD基因的完全缺失,而DEL表型形成的主要分子機(jī)制為RHD基因1227G>A突變。PCR-SSP結(jié)果顯示5例標(biāo)本第9外顯子均有1227G>A突變,其中4例純合子,1例雜合子,說(shuō)明RhD 1227A是南昌地區(qū)DEL表型個(gè)體的重要遺傳標(biāo)記。

        在中國(guó),DEL型在RhD陰性人群中占比較高,且一直將DEL當(dāng)作RhD陰性用于臨床輸血。而在國(guó)內(nèi)外均有RhD陰性受血者輸注DEL型紅細(xì)胞產(chǎn)生抗-D同種免疫的文獻(xiàn)報(bào)道[17-20]。因此,增加樣本量、調(diào)查DEL型分布特點(diǎn)、進(jìn)一步揭示DEL型遺傳背景以及基因多態(tài)性,對(duì)提高臨床輸血安全性具有重要意義。

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