張瑩瑩，余真強(qiáng)，熊建平，陳火玲，杜忻，徐晶

(南昌市中心血站，江西 南昌330025)

DEL型作為RhD血型中的一種特殊變異體，其輸血安全性一直存在爭(zhēng)議。已有研究學(xué)者提出將DEL型從RhD陰性獻(xiàn)血者中篩選出來(lái)，避免產(chǎn)生同種異體免疫[1，2]。在中國(guó)，陰性人群中DEL型占有較高的比例，且遺傳學(xué)背景非常復(fù)雜，DEL型的準(zhǔn)確鑒定對(duì)確保陰性患者的臨床輸血安全具有重要的指導(dǎo)意義[3－5]。為調(diào)查南昌地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者中DEL表型分布以及與各地DEL型表型分布進(jìn)行比較，本課題應(yīng)用酸吸收放散及PCR－SSP實(shí)驗(yàn)方法從RhD陰性獻(xiàn)血者中篩查DEL表型并進(jìn)行基因分型，為制定南昌地區(qū)DEL型輸血策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 2017年2月至2018年1月南昌市中心血站RhD陰性獻(xiàn)血者樣本，共計(jì)107例。

1.2 試劑與儀器 抗－A、抗－B試劑、ABO紅細(xì)胞、抗體篩選細(xì)胞 （上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；抗－AB 試劑（法國(guó) DIAGAST）；凝聚胺試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；IgM型單克隆抗－D試劑、IgG型單克隆抗－D試劑 (上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)；IgM+IgG型單克隆抗－D試劑(英國(guó)Millipore（UK）Ltd)；人源抗－D 血清(我站自制，抗體效價(jià)＞256)；抗－C、抗－c、抗－E、抗－e 單克隆抗體檢測(cè)試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；酸吸收放散試劑（廣州展全生物科技有限公司）；引物、DNA 提取試劑盒（Innotrain）；Taq 酶（Promega）；久保田離心機(jī)（KA－2002）；GRIFOLS 離心機(jī)（DGTherm）；GRIFOLS 孵 育 器 （DGSpin）；PCR 擴(kuò) 增 儀（SimpliAmp）；凝膠成像儀（G：BOX F3）。

1.3 方法

1.3.1 RhD陰性確認(rèn) 對(duì)鹽水法初篩為RhD陰性的樣本用抗人球蛋白法確認(rèn)，并進(jìn)行C、c、E、e抗原分型。

1.3.2 酸吸收放散 將確認(rèn)為RhD陰性的樣本取200μl紅細(xì)胞，洗滌3次制成壓積紅細(xì)胞，加入等體積人源－D，混合均勻，37℃水浴30min，洗滌6次制成壓積紅細(xì)胞，將等體積酸放散試劑加入吸收紅細(xì)胞，迅速混勻離心，3400r/min，離心1min，取放散液100μl，將pH調(diào)節(jié)劑滴入放散液調(diào)至中性，加入50μl O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞，37℃水浴1h，用微柱凝膠方法檢測(cè)放散結(jié)果。

1.3.3 PCR－SSP 將酸吸收放散陽(yáng)性的 5 例 DEL 型樣本送至廣州血液中心，通過PCR－SSP方法進(jìn)行RhD基因檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhD陰性獻(xiàn)血者表型分布 107例RhD陰性獻(xiàn) 血 者 中 ccee 53 例 （49.53% ），Ccee 37 例（34.58% ），CCee 11 例 （10.28% ），CcEe 3 例（2.80%），ccEe 3 例（2.80%）。

2.2 中國(guó)各地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者DEL型分布特征 107例陰性獻(xiàn)血者中檢出DEL型30例（28.04%），與上海地區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.02，P＜0.05），與其它地區(qū)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 南昌與各地RhD陰性獻(xiàn)血者DEL型分布比較

2.3 DEL型獻(xiàn)血者表型分布 檢出DEL型30例，占比為 28.04%，其中 Ccee 23 例（76.67%），CCee 7例(23.33%)，與各地區(qū)DEL型獻(xiàn)血者表型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表2 南昌與各地DEL型獻(xiàn)血者表型分布比較

2.4 PCR－SSP基因分型結(jié)果 5例DEL型標(biāo)本第9外顯子均有1227G＞A突變，其中雜合子4例，純合子1例，見圖1。

圖1 PCR-SSP基因分型結(jié)果

3 討論

RhD是繼ABO血型系統(tǒng)之后最重要的血型系統(tǒng)，在臨床輸血、自身免疫性溶血以及新生兒溶血中有著重要意義[10－12]。DEL型作為特殊的RhD變異體，其重要性受到廣泛關(guān)注。本研究顯示，在南昌地區(qū)的107例RhD陰性獻(xiàn)血者中30例為DEL型，占 28.04%，除與上海（P＜0.05）地區(qū)存在統(tǒng)計(jì)差異外，與其它地區(qū)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DEL型在南昌地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者中占比較高，因此深入研究DEL型對(duì)提高臨床輸血安全性具有重要意義。

本研究的30例DEL型樣本中，RhCE表型主要為 Ccee（76.7%）和 CCee（23.3%），與浙江、上海、臺(tái)灣和福州的研究結(jié)果相似 （P＞0.05），說(shuō)明DEL型與Ce單倍體關(guān)系密切，可能與RhD基因和RhCe 基因緊密連鎖有關(guān)[13－16]。

對(duì)于RhD陽(yáng)性個(gè)體來(lái)說(shuō)，至少擁有一條正常RHD基因，RhD陰性個(gè)體的主要分子機(jī)制在于RHD基因的完全缺失，而DEL表型形成的主要分子機(jī)制為RHD基因1227G＞A突變。PCR－SSP結(jié)果顯示5例標(biāo)本第9外顯子均有1227G＞A突變，其中4例純合子，1例雜合子，說(shuō)明RhD 1227A是南昌地區(qū)DEL表型個(gè)體的重要遺傳標(biāo)記。

在中國(guó)，DEL型在RhD陰性人群中占比較高，且一直將DEL當(dāng)作RhD陰性用于臨床輸血。而在國(guó)內(nèi)外均有RhD陰性受血者輸注DEL型紅細(xì)胞產(chǎn)生抗－D同種免疫的文獻(xiàn)報(bào)道[17－20]。因此，增加樣本量、調(diào)查DEL型分布特點(diǎn)、進(jìn)一步揭示DEL型遺傳背景以及基因多態(tài)性，對(duì)提高臨床輸血安全性具有重要意義。