周楠楠，樓宵瑋，王 穎，潘道東，孫楊贏，黨亞麗，曹錦軒*

（浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211）

糟肉是我國(guó)的傳統(tǒng)特色食品，以其典型的糟鹵風(fēng)味著稱于世，廣泛受到浙江、上海、江蘇、廣東等各地區(qū)人民的喜好。糟肉一般以豬肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、禽蛋、水產(chǎn)品等為原料，經(jīng)過(guò)清洗、煮制后，低溫腌制，最后經(jīng)過(guò)干糟或者濕糟鹵汁進(jìn)行糟制而成。糟鴨是糟肉中的代表性產(chǎn)品，色澤潔白，口感細(xì)膩，風(fēng)味濃郁。國(guó)內(nèi)糟鴨的加工主要有2 種常見(jiàn)工藝類型，其中干糟是將腌制的鴨肉采用干酒糟直接糟制而成，而濕糟是將腌制的鴨肉浸入由鴨湯和酒糟、黃酒萃取制得的糟鹵中浸泡制備。風(fēng)味主要包括氣味和滋味，作為食品的重要特性之一，滋味對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量和消費(fèi)者購(gòu)買量具有重要影響[1]。大量研究表明，鴨肉和鴨肉制品中主要非揮發(fā)性滋味物質(zhì)包括游離氨基酸、小肽、核苷酸等[2-3]。干糟和濕糟由于其不同的糟制方式，以及干糟和濕糟的糟制劑（酒糟和糟鹵）化合物種類、含量不同，糟制劑擴(kuò)散速率不同，會(huì)形成不同的滋味。目前，有關(guān)糟鴨加工過(guò)程中的小分子滋味化合物的相關(guān)文獻(xiàn)較少，糟鴨滋味特征性化合物種類和含量并不清楚。

研究表明，基于1H核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)出樣品中的多種小分子代謝物[4]。Graham等[5]研究牛肉成熟過(guò)程中核苷酸和游離氨基酸的NMR信號(hào)變化，發(fā)現(xiàn)宰后21 d成熟過(guò)程中12 種氨基酸含量顯著升高。Castejón等[6]利用NMR分析宰后牛肉滲出液的代謝物含量，報(bào)道23 種不曾在肉制品中發(fā)現(xiàn)的化合物。Zanardi等[7]通過(guò)NMR識(shí)別輻照牛肉特有的代謝生化標(biāo)示物主要有3 類：甘油、乳酸酯類和酪胺（或者p-取代酚類化合物）。與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜相比，NMR技術(shù)能夠更快速地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)[8]。因此，該項(xiàng)技術(shù)被認(rèn)為是一種先進(jìn)的高通量代謝組學(xué)分析方法[5,9]。Liu Chunli等[3]采用NMR技術(shù)快速測(cè)定鴨肉中的代謝物，包括氨基酸、羧酸、糖類、核苷酸。Chen Daian等[4]基于NMR技術(shù)系統(tǒng)闡明糟帶魚(yú)中的小分子營(yíng)養(yǎng)化合物，主要為有機(jī)酸、氨基酸、醇類、糖類。這些被NMR鑒定出的小分子化合物不僅是產(chǎn)品加工和貯藏過(guò)程中代謝物，也是肉制品中重要的滋味物質(zhì)。然而，NMR技術(shù)能否適用于檢測(cè)糟鴨加工過(guò)程中的滋味物質(zhì)，仍缺乏相關(guān)研究。

鑒于此，本研究采用NMR技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法，分析糟鴨加工過(guò)程中的關(guān)鍵工序?qū)π》肿幼涛段镔|(zhì)含量的影響，以期闡明糟鴨產(chǎn)品的滋味形成機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番鴨（日齡105～110 d，體質(zhì)量（2 845±224）g），除去內(nèi)臟的冷鮮白條鴨購(gòu)買自寧波市樂(lè)購(gòu)超市；3 a陳黃酒糟 嵊州市崇仁東升酒廠。

重水（D2O，99.9%）、三甲基甲硅烷基丙酸（3-(trimethylsilyl) propionic-2,2,3,3-d4acid sodium salt，TSP） 美國(guó)CIL公司；其他試劑（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

組織均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司；冷凍離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；真空離心濃縮機(jī)美國(guó)Labconco公司；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；AVIII 600 MHz NMR儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 糟鴨加工工藝

20 只番鴨洗凈，沿著胸膛肋骨中線一分為二，取10 個(gè)半胴體作為生鴨樣品。剩余30 個(gè)半胴體按照料液比1∶2（g/mL）加入自來(lái)水，煮至大約15 min，鴨肉能被筷子扎透，取出自然冷卻。鴨肉冷卻后，用3%精鹽抹勻，4 ℃低溫腌制12 h。鹽腌后取10 個(gè)半胴體作為鹽腌樣品，剩余20 個(gè)半胴體鴨肉分為2 組，一組用于制作干糟產(chǎn)品，另一組用于制作濕糟產(chǎn)品。

干糟產(chǎn)品糟制工藝：向酒糟中加入3%精鹽拌勻，揉搓成團(tuán)待用。陶罐底部鋪上一層酒糟，罩上一層透氣性良好的紗布，碼一層鴨肉，交替碼酒糟和鴨肉，酒糟和鴨肉質(zhì)量比為1∶1，最上層以酒糟塞住瓶口，封上保鮮膜和陶罐蓋。

濕糟產(chǎn)品糟制工藝：將酒糟和黃酒完全拌勻至沒(méi)有結(jié)塊為止，酒糟和黃酒料液比1∶1（g/mL）。糟酒混合物壓濾，所得汁液為糟露。煮制坯料的湯汁撇去浮油，過(guò)濾待用。糟露、鴨肉湯汁、精鹽、味精、醬油混勻即成糟鹵，其中糟露10 L、鴨湯200 L、鹽0.3 kg、味精0.03 kg、醬油0.13 L。將冷卻后的鹽腌鴨坯平鋪于陶罐中，倒入糟鹵使其高過(guò)肉面，封上保鮮膜和陶罐蓋。

將干糟和濕糟產(chǎn)品的陶罐置于4 ℃，共糟制7 d得成品，分別各取10 只生鮮樣品、鹽腌鴨肉、干糟成品、濕糟成品為樣本，重復(fù)數(shù)為10 個(gè)。選取鴨胸肉樣品為測(cè)試對(duì)象，剔出胸肉，用錫箔紙包好，于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 代謝化合物的提取

傳統(tǒng)金融信用評(píng)估模型雖然可以在信用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有一定評(píng)估作用，但是大數(shù)據(jù)的出現(xiàn)導(dǎo)致其數(shù)據(jù)出現(xiàn)了更多的信息維度。除了交易結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)本身，還有大量的其他類型數(shù)據(jù)，如：企業(yè)水電數(shù)據(jù)、企業(yè)高管人員數(shù)據(jù)、相關(guān)企業(yè)信息數(shù)據(jù)等，上述數(shù)據(jù)均不兼容于傳統(tǒng)評(píng)估模型，導(dǎo)致最終信息出入較大，所以必須設(shè)計(jì)新的金融信用評(píng)估模型。這就需要利用大數(shù)據(jù)下的信用評(píng)估分析，原理如圖1所示。

稱取0.4 g鴨胸肉樣品，加入1 mL的甲醇-水（2∶1，V/V）混合液和1 g研磨珠于帶蓋破碎管中。在組織均質(zhì)儀上以4 260 r/min破碎30 s，冰浴30 s，共重復(fù)5 次。取出后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)加入甲醇溶液，破碎，離心。合并2 次離心所得的上清液，利用離心濃縮機(jī)除去有機(jī)溶劑后冷凍干燥。冷凍干燥后所得的代謝物重懸于550 μL Na+/K+緩沖液（0.15 mol/L，含有0.015% TSP和50% D2O，pH 7.4），4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，取500 μL上清液于5 mm NMR核磁管中待檢。每種樣品做10 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 NMR分析

樣品1D1H NMR譜采集，在配備有超低溫探頭的Bruker AVIII 600 MHz NMR儀上完成，質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。譜寬為δ20，等待時(shí)間為2 s，混合時(shí)間為80 ms，90°脈寬為18 μs，采樣時(shí)間為1.36 s，采樣點(diǎn)數(shù)為32 K，F(xiàn)ID累加次數(shù)為32 次。

采用1D1H NMR譜上出峰較強(qiáng)的樣品，分別檢測(cè)1H J，1H-1H COSY，1H-1H TOCSY，1H-13C HMBC和1H-13C HSQ這一系列的2D NMR譜，從而對(duì)1D1H NMR譜上的信號(hào)進(jìn)行歸屬。操作方法和相關(guān)參數(shù)參考課題組先前的實(shí)驗(yàn)方法[3]。各代謝物的指認(rèn)根據(jù)與The Metabolomics Innovation Centre數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)來(lái)確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)1H NMR譜，使用TOPSPIN軟件進(jìn)行手動(dòng)定內(nèi)標(biāo)和調(diào)平基線，使用AMIX軟件將樣品1H NMR譜從δ9.0～0.8按δ0.004分段進(jìn)行積分，除去水峰（δ5.17～4.75）以及甲醇峰（δ3.38～3.35）所在化學(xué)位移區(qū)域。數(shù)據(jù)歸一化處理后，導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）圖和正交偏最小方差判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。所有的OPLS-DA模型采用CV-ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)[9]，P＜0.05，差異顯著。代謝物的相關(guān)系數(shù)圖使用MATLAB 7.1軟件所得。代謝物含量測(cè)定，根據(jù)其非重疊信號(hào)峰面積與已知濃度內(nèi)標(biāo)TSP比值計(jì)算，具體計(jì)算公式和過(guò)程參考Dai Hui等[10]的方法。

不同工藝點(diǎn)各代謝物含量，采用SAS 8.0中one-way ANOVA的Duncan's multiple range test模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 1H NMR分析

圖1為生鴨肉（A）、干糟產(chǎn)品（C）和酒糟（E）的1H NMR圖譜。2D NMR譜對(duì)代謝物的信號(hào)歸屬結(jié)果如表1所示。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到鴨肉和糟制劑中的代謝物共34 種，包括15 種氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、焦谷氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、?；撬帷⒏拾彼?、酪氨酸、苯丙氨酸）、6 種有機(jī)酸（乳酸、乙酸、琥珀酸、肌酸、肌酸酐、甲酸）、2 種糖（葡萄糖、麥芽糖）、6 種核苷酸及其衍生物（尿嘧啶、尿苷、胞苷酸（5′-cytidine monophosphate，5′-CMP）、次黃嘌呤、肌苷、肌苷酸（5′-inosinate，5′-IMP））、2 種醇（乙醇、2,3-丁二醇）、3 種堿（膽堿、甜菜堿、甘油磷酸膽堿）。大部分物質(zhì)在關(guān)于鴨肉代謝物和糟帶魚(yú)代謝物的研究中已有報(bào)道[3-4]。

圖1 生鴨肉（A）、干糟產(chǎn)品（C）和酒糟（E）的1H NMR譜圖Fig. 1 Representative 1H NMR spectra of metabolites extracts from raw duck (A), dry vinasse-cured duck (C) and vinasse (E)

表1 鴨肉和酒糟的NMR信號(hào)歸屬Table 1 NMR data of metabolites detected in vinasse-cured duck and vinasse

2.2 PCA結(jié)果

圖2 糟鴨加工過(guò)程中代謝物的主成分分析圖Fig. 2 PCA plot for metabolites of vinasse-cured duck during processing

2.3 糟鴨加工過(guò)程中代謝物的變化

OPLS-DA模型的準(zhǔn)確性采用R2X和Q2評(píng)估，CV-ANOVA的結(jié)果用p值體現(xiàn)。這3 個(gè)數(shù)值均體現(xiàn)組間結(jié)果的顯著性和模型可信度。本研究中，相關(guān)系數(shù)大于0.602被認(rèn)為存在顯著差異。向上的峰代表在后者樣品中該代謝物的含量高于前者，反之亦然。系數(shù)圖中代謝物峰的顏色越紅，代表兩者之間的差異越顯著。

如圖3所示，在煮制、鹽腌過(guò)程中，鴨肉中的琥珀酸、肌酸酐、膽堿、次黃嘌呤含量升高，而氨基酸、乳酸、肌酸、甘油磷酰膽堿、糖類、肌苷、5′-IMP含量下降。在干糟過(guò)程中，鴨肉中的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、有機(jī)堿、糖類、肌苷含量升高，而肌酸、肌酸酐含量下降。在濕糟過(guò)程中，鴨肉中的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、有機(jī)堿、葡萄糖含量上升，而乳酸、琥珀酸、肌酸、肌酸酐、麥芽糖、5′-IMP含量下降。和干糟產(chǎn)品相比，濕糟產(chǎn)品的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、有機(jī)堿、葡萄糖含量較高，而乳酸、琥珀酸、肌酸、肌酸酐、麥芽糖、5′-IMP含量較低。

如表2所示，鴨肉中含量最高的物質(zhì)為天冬氨酸、乳酸、肌酸、葡萄糖和5′-IMP。Chen Daian等[4]在糟帶魚(yú)中同樣測(cè)定出含量最高的物質(zhì)為乳酸、肌酸和葡萄糖。除琥珀酸、肌酸酐、膽堿、次黃嘌呤外，大多數(shù)代謝物的含量在煮制鹽腌過(guò)程中下降（P＜0.05）。糟制過(guò)程促使糟鴨中的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、甘油磷酸膽堿、葡萄糖含量上升（P＜0.05），但使其他酸類含量下降（P＜0.05）。濕糟比干糟對(duì)糟鴨滋味含量變化影響更顯著（P＜0.05），這可能是因?yàn)闈裨銤B透比干糟遷移速率更快。糟鴨中代謝物含量結(jié)果與OPLS-DA結(jié)果一致。

圖3 生鴨肉和鹽腌鴨肉（a）、鹽腌鴨肉和干糟產(chǎn)品（b）、鹽腌鴨肉和濕糟產(chǎn)品（c）、干糟產(chǎn)品和濕糟產(chǎn)品（d）的正交偏最小方差判別分析Fig. 3 OPLS-DA results generated by comparisons of spectra between raw duck and salted duck (a), salted duck and dry vinasse-cured duck (b),salted duck and wet vinasse-cured duck (c), and dry and wet vinasse-cured duck (d), respectively

表2顯示，酒糟和糟鹵中含有大量與糟鴨產(chǎn)品滋味物質(zhì)相同的代謝物，如異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、乙醇、乳酸、葡萄糖等。這些物質(zhì)在糟制過(guò)程中能夠通過(guò)擴(kuò)散作用滲透進(jìn)鴨肉中，形成糟鴨的特征滋味。此外，由于酒糟是黃酒釀造后留下的殘?jiān)约包S酒生產(chǎn)中的發(fā)酵劑，酒糟中會(huì)殘留多種黃酒發(fā)酵所需的微生物，如酵母、真菌和細(xì)菌[11]。這些微生物可能在糟制過(guò)程中發(fā)揮作用，分泌特定的酶，從而影響糟鴨中代謝物的變化。

根據(jù)OPLS-DA和定量分析的結(jié)果，幾乎所有的氨基酸含量在煮制鹽腌過(guò)程中下降，糟制過(guò)程中上升。此結(jié)果與鹽水鴨加工過(guò)程中游離氨基酸的報(bào)道[12]一致，鹽水鴨在鹽腌和煮制過(guò)程中，游離氨基酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。Dai Yan等[13]研究同樣顯示，南京鹽水鴨在經(jīng)過(guò)熱處理后，其游離氨基酸含量也會(huì)減少。但是，在板鴨加工過(guò)程中氨基酸變化研究中，鹽腌促使游離氨基酸含量的增加，可能原因是加工工藝的差異以及游離氨基酸含量在煮制過(guò)程中劇烈下降。

在煮制和鹽腌過(guò)程中，鴨肉中的游離氨基酸會(huì)參與反應(yīng)，生成揮發(fā)性風(fēng)味化合物或者降解成其他物質(zhì)[14]，與揮發(fā)性化合物變化的結(jié)果一致。對(duì)于酒糟中含有的氨基酸，糟鴨在糟制后均有顯著升高，因此，這些氨基酸可能來(lái)源是糟制劑[15]。對(duì)于酒糟中未被檢出的氨基酸，糟鴨在糟制過(guò)程中這些物質(zhì)含量的升高可能歸因于鴨肉中殘留的內(nèi)源蛋白酶以及酒糟中真菌和細(xì)菌分泌的蛋白水解酶[16-17]。糟鴨中含量最高的游離氨基酸是丙氨酸（干糟產(chǎn)品：0.38 mg/g；濕糟產(chǎn)品：0.31 mg/g）、天冬氨酸（干糟產(chǎn)品：2.06 mg/g；濕糟產(chǎn)品：3.15 mg/g）、?；撬幔ǜ稍惝a(chǎn)品：0.95 mg/g；濕糟產(chǎn)品：1.03 mg/g）、甘氨酸（干糟產(chǎn)品：0.28 mg/g；濕糟產(chǎn)品：0.31 mg/g），其中丙氨酸和甘氨酸呈甜味[18]，天冬氨酸呈鮮味[19]。糟鴨中的苦味氨基酸，比如亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等[20]，其呈味作用可以被糖、鹽等物質(zhì)抑制[21]。通過(guò)比較滋味閾值[22]可知，天冬氨酸對(duì)糟鴨的鮮味貢獻(xiàn)較大。

表2 糟鴨加工過(guò)程中代謝物含量及OPLS-DA相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coef fi cients from OPLS-DA and metabolite contents in vinasse-cured duck extracts at different sampling time points

酒糟和糟鹵中含有大量的葡萄糖[23]。此外，糟制劑中含有釀酒酵母和芽孢桿菌可以分泌淀粉酶和葡聚糖酶等[11]。因此葡萄糖的增加可能來(lái)源于糟制劑，以及糟制過(guò)程中多糖的分解[24]。麥芽糖在干糟和濕糟過(guò)程中含量降低，可能是因?yàn)樵阒苿┲袣埩舻柠溠刻敲笇⑵浒l(fā)酵分解成葡萄糖[25]。代謝物中醇類和酸類的變化與碳水化合物發(fā)酵有關(guān)[26]。有研究報(bào)道，酒的發(fā)酵劑中含有大量的釀酒酵母和乳酸桿菌[27]。這些化合物會(huì)參與發(fā)酵，將葡萄糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸，而后再代謝成醇類和酸類[4]。乙酸、甲酸、乙醇、2,3-丁二醇在糟制期間含量升高，主要源于糟制劑滲透和微生物發(fā)酵[28]。此外，肌酸和肌酸酐含量的下降有可能是分解生成精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸[29]。

肌苷和磷酸構(gòu)成5′-IMP，次黃嘌呤和核糖構(gòu)成肌苷[30]。在煮制鹽腌過(guò)程中，5′-IMP和肌苷含量下降，次黃嘌呤含量上升，說(shuō)明5′-IMP和肌苷降解生成次黃嘌呤[31]。在糟制過(guò)程中，5′-IMP和肌苷進(jìn)一步降解生成次黃嘌呤。上述變化說(shuō)明糟鴨加工過(guò)程中與核苷酸有關(guān)的鮮味物質(zhì)顯著下降。

3 結(jié) 論

本研究采用NMR檢測(cè)糟鴨、糟制劑中的滋味成分，共測(cè)出34 種物質(zhì)，包括14 種氨基酸、7 種有機(jī)酸、2 種糖、6 種核苷酸及其衍生物、2 種醇、3 種堿。糟鴨加工過(guò)程中，氨基酸、醇類、堿類、糖類含量在煮制、鹽腌過(guò)程中下降，糟制過(guò)程中上升。甲酸、次黃嘌呤持續(xù)升高，而乳酸、肌酸、5′-IMP和肌苷含量則持續(xù)下降。濕糟比干糟過(guò)程對(duì)滋味化合物含量的影響更顯著。糟鴨加工過(guò)程中的代謝物含量變化與蛋白質(zhì)、多糖降解，滋味物質(zhì)滲透以及糟制劑中殘存微生物和酶作用有關(guān)。