陳美林，杜芬妮，陳 業(yè)，程 超，單長海，莫開菊,3,*

（1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.國家富硒產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué) 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

1973年世界衛(wèi)生組織專家委員會正式宣布，硒是人體生理必需的微量元素，1988年中國營養(yǎng)學(xué)會將硒列為15 種微量元素之一[1]。硒在增強抗氧化、提高免疫力和預(yù)防癌癥等方面有重要功效[2-3]?？松讲?、惡性腫瘤、高血壓、冠心病、肝病、貧血、大骨節(jié)病、糖尿病、妊娠高血壓綜合征、阿爾茨海默病、癲癇等多種疾病與缺硒有關(guān)[4-5]。自然界中硒以無機硒和有機硒形式存在，無機硒以亞硒酸鈉和硒酸鈉形式存在，有機硒主要是硒與氨基酸結(jié)合，主要為硒代甲硫氨酸，血清攜帶的硒90%與白蛋白結(jié)合，只有10%以低分子質(zhì)量硒酸鹽的形式存在[6]。硒與VE構(gòu)成動物機體抗氧化的兩條防御途徑，兩者共同發(fā)揮作用，硒是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組分，在體內(nèi)特異催化還原谷胱甘肽與過氧化物的氧化還原反應(yīng)，如過氧化氫、超氧陰離子自由基、羥自由基、脂酰自由基，從而保護生物膜免受損害，維持細(xì)胞的正常功能[7]。此外，硒與重金屬具有較強的親和力，在體內(nèi)能形成金屬-硒-蛋白質(zhì)復(fù)合物而起解毒作用，硒還參與輔酶A、輔酶Q的合成等[8]。適量硒的攝入有助于身體健康，但硒攝入過量也會引發(fā)中毒，表現(xiàn)為指甲和頭發(fā)脫落，伴隨惡心、嘔吐、疲勞、腹瀉、腹痛、汗液有酸臭味等，重者表現(xiàn)為支氣管炎、高熱、直立性低血壓、肝腫大，甚至虛脫、呼吸衰竭而死[9]，增加心血管疾病如II型糖尿病[10]、高血壓[11]和血脂異常[12]的發(fā)病率，長期高硒使幼兒發(fā)育遲緩，甚至誘發(fā)神經(jīng)癥狀和智能改變[10]。

中國既有豐富的硒資源，又存在大面積硒缺乏地區(qū)，我國有72%地區(qū)處于缺硒、低硒帶，膳食中硒攝入量不足[13]，需要通過富硒食品補充。中國營養(yǎng)學(xué)會通過對我國13 個省市居民大面積的營養(yǎng)水平調(diào)查，提出我國成人每日硒的攝入量為50～400 μg為宜[14]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和國際原子能機構(gòu)采用我國人體硒含量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，提出成人每天膳食硒攝入量為50～250 μg，膳食硒最高安全攝入量為400 μg/d，人體硒中毒界限量為800 μg/d[15]?？梢?，硒的安全攝入范圍窄，只有明確食品中的硒含量，才能合理補硒。

GB 5009.93—2017《食品中硒的測定》[16]規(guī)定食品中硒含量測定的方法有氫化物原子熒光光譜法、熒光分光光度法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法。這些方法需要精密的儀器設(shè)備，繁瑣的前處理，操作復(fù)雜、耗時長，試劑毒性較大，需要配備專業(yè)的操作人員[17]。紅外光譜技術(shù)是利用分子吸收紅外光產(chǎn)生分子振動原理，以吸收光譜的峰位置和相對強度變化反映物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和含量變化，能快速、準(zhǔn)確、靈敏測定食品中的化學(xué)成分且無試劑參與，綠色環(huán)保。20世紀(jì)初首次獲得有機化合物的近紅外光譜，近紅外光譜用于定量分析則起源于20世紀(jì)60年代，但60年代中后期暴露出靈敏度低、抗干擾性差等弱點而受到冷落，直到70年代產(chǎn)生的化學(xué)計量學(xué)使近紅外光譜定量分析技術(shù)獲得新生，尤其是80年代后期，計算機技術(shù)的迅速發(fā)展助推近紅外光譜技術(shù)的定量應(yīng)用[18-19]。我國近紅外技術(shù)90年代中期才起步，2009年我國成立了近紅外光譜專業(yè)委員會，近紅外光譜技術(shù)研究與發(fā)展呈現(xiàn)蓬勃之勢[20]。

但是隨著近紅外光譜定量分析數(shù)量增多，發(fā)現(xiàn)其具有幾個不足：光譜特征性不強、光譜強度低、譜帶寬、重疊嚴(yán)重，通常用于OH、NH、CH等基團的定量分析，其結(jié)果取決于校正集和計量學(xué)方法而且泛化性差，因此其測試靈敏度相對較低，其目標(biāo)成分相對含量一般在0.1%左右。所以對于目標(biāo)成分很低的物質(zhì)，必須尋找更靈敏的方法。

中紅外光譜是基于化學(xué)成分中基團的基頻振動而產(chǎn)生，具有高度特征性，可利用其化學(xué)鍵的特征波數(shù)鑒別化合物并定量測定[21]，但是更多用于化合物的定性鑒別，較少用于定量分析，原因是化合物中每個官能團都有幾種振動形式，產(chǎn)生的紅外光譜比較復(fù)雜，難以發(fā)現(xiàn)其特征吸收峰，因而難以以某單一峰的強度作為定量分析的依據(jù)，尤其是像食品這樣多成分的復(fù)雜體系中微量成分的定量分析則少之又少。然而中紅外的基頻吸收強度大，靈敏度更高，比近紅外倍頻或合頻吸收高1～3 個數(shù)量級，因此采用衰減全反射中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量法測定米粉中極其微量硒代甲硫氨酸的硒含量將是一項有益的探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北大米 市售；硒代甲硫氨酸（98%） 銻希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS5傅里葉變換中紅外光譜儀、iD7 Transmission 衰減全反射附件 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

大米在粉碎機內(nèi)粉碎過140 目篩，45 ℃烘4 h備用。

硒代甲硫氨酸（以硒計）溶液配制：稱量硒代甲硫氨酸0.127 g（0.05 g）用去離子水定容至50 mL（1 mg/mL），取1 mL用去離子水定容至10 mL配成硒質(zhì)量濃度為100 μg/mL。取2.5 mL用去離子水定容至250 mL配成1 μg/mL溶液。

將1 μg/mL溶液用去離子水分別稀釋成1、0.98、0.96、…、0.1、0.05、0 μg/mL的溶液，各取10 mL分別與10 g米粉混勻配成硒含量梯度分別為100、98、96、…、10、5、0 μg/100 g的樣品，烘箱45 ℃烘6 h后研缽里研磨均勻。共制備48 個樣品。

1.3.2 樣品光譜采集

取適量樣品置于衰減全反射附件的晶體上，壓實；光譜掃描范圍：4 000～400 cm-1；掃描次數(shù)：32 次；掃描間隔：2 cm-1；每個樣本分別采集3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用TQ Analyst進行數(shù)據(jù)處理、偏最小二乘（partial least squares，PLS）法建模和校驗。

建立定量分析模型，打開TQ Analyst軟件，建模窗口從左向右設(shè)置參數(shù)，計算校正模型，采用Diagnostics下的Cross-Validation對模型作內(nèi)部交叉驗證。模型內(nèi)部穩(wěn)健性和擬合效果以決定系數(shù)（coefficient of determination，）、校正均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）、模型內(nèi)部預(yù)測能力以決定系數(shù)和交叉驗證均方差（root-mean-squares error of cross-validation，RMSECV）為評價指標(biāo)。所建模型對驗證集樣品的預(yù)測能力以決定系數(shù)和預(yù)測均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）為評價指標(biāo)。均以決定系數(shù)越大、均方差越小，所對應(yīng)的模型擬合效果及預(yù)測效果越好。此外還用相對分析誤差（residual predictive deviation，RPD）評價模型的預(yù)測能力，RPD能消除因樣本集不同而造成的影響，使預(yù)測準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)化，值越大，所對應(yīng)校正模型的預(yù)測性能越好。Malley等[22]提出校準(zhǔn)的指導(dǎo)建議：＞0.95，RPD＞4，模型極好；RP2=0.9～0.95，RPD=3～4，模型成功；RP2=0.8～0.9，RPD=2.25～3，模型較成功；=0.7～0.8，RPD=1.75～2.25，模型適度有用；0.7，對于篩選目的可能有用。

留一法適用于樣本量較少時，當(dāng)樣本量較大時，留一法計算較繁瑣，耗時。留多驗證則改進計算的復(fù)雜性，但通常會產(chǎn)生不可忽略的偏差[23]；當(dāng)樣本量很大時留多驗證可以減輕計算量，節(jié)約時間。鑒于本實驗樣本量適中，因此驗證實驗采用留一與留多方法比較研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 波段選擇結(jié)果

多組分樣品紅外光譜數(shù)據(jù)集相對較大，難以簡單辨析物質(zhì)的特征吸收光譜，因此需要合理選擇光譜區(qū)間進行分析[24]。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸紅外吸收圖譜主要區(qū)別在波數(shù)1 600～440 cm-1，又由于650～400 cm-1噪音大且背景值也相對較大。因此取1 600～650 cm-1為特征吸收光譜。

圖1 紅外光譜圖Fig. 1 Infrared spectra

2.2 模型建立與校驗結(jié)果

2.2.1 留一法結(jié)果

表1 留一法PLS模型參數(shù)Table 1 Parameters of the PLS model developed by leave-one-out method

每次留一個樣本作為驗證數(shù)據(jù)，其余（47 個樣本）用于建模，模型內(nèi)部采用留一交差驗證。由表1可知，原始數(shù)據(jù)和經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)及二階導(dǎo)數(shù)處理數(shù)據(jù)所建PLS模型都較好。二階導(dǎo)數(shù)處理后模型RC2大于一階導(dǎo)數(shù)、RMSEC小于一階導(dǎo)數(shù)RMSEC，說明二階導(dǎo)數(shù)模型擬合效果較好；但二階導(dǎo)數(shù)處理后模型RMSECV大于一階導(dǎo)數(shù)，說明模型內(nèi)部預(yù)測能力不如一階導(dǎo)數(shù)，且二階導(dǎo)數(shù)因子數(shù)多于一階導(dǎo)數(shù)，這種現(xiàn)象可能預(yù)示存在二階導(dǎo)數(shù)過度擬合。但導(dǎo)數(shù)處理都比原始數(shù)據(jù)好。

表2 驗證數(shù)據(jù)預(yù)測效果Table 2 Results of prediction with validation set

進一步采用驗證數(shù)據(jù)對模型進行外部驗證，其預(yù)測驗證相關(guān)參數(shù)見表2。結(jié)果顯示經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理和原始數(shù)據(jù)各參數(shù)都達(dá)到極高水平。經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后預(yù)測值與真實值的決定系數(shù)達(dá)到0.98以上，其RPD較原始數(shù)據(jù)增大，說明經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后預(yù)測值與真實值之間的整體方差較小，相對原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性均有所提高。一階導(dǎo)數(shù)處理后模型的預(yù)測效果比二階導(dǎo)數(shù)略好，一階導(dǎo)數(shù)模型驗證數(shù)據(jù)的預(yù)測值與真實值的相對偏差在20%以內(nèi)的占92.91%、10%以內(nèi)占82.27%；二階導(dǎo)數(shù)模型驗證數(shù)據(jù)的預(yù)測值與真值的相對偏差在20%以內(nèi)的占92.20%、10%以內(nèi)占78.72%，與模型結(jié)果一樣，說明一階導(dǎo)數(shù)最好，二階導(dǎo)數(shù)的預(yù)測能力略次。

圖2 預(yù)測值與真值相關(guān)性比較Fig. 2 Correlation between predicted and true values

由圖2可知，一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)點較均勻地分散在直線兩側(cè)，而原始數(shù)據(jù)在低濃度和高濃度區(qū)則是非均勻分散在直線兩側(cè)。一階導(dǎo)數(shù)的數(shù)據(jù)點多數(shù)離直線較緊密，少數(shù)離直線較遠(yuǎn)，二階導(dǎo)數(shù)的數(shù)據(jù)點較分散地分布在直線附近，比一階導(dǎo)數(shù)整體分散，決定系數(shù)也反映出這點，一階導(dǎo)數(shù)決定系數(shù)較大，整體偏差較小，線性更好。

2.2.2 留多法結(jié)果

為保證驗證集分布較均勻，將全部樣本分為低中高濃度，分別用隨機數(shù)表產(chǎn)生1/3（共16 個樣本）的樣本作為驗證集，2/3（共32 個樣本）作為建模集，這樣能保證校正集和預(yù)測集都包含不同含量的樣本。模型內(nèi)部采用留一交差驗證法。

由表3可知，經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后變大、RMSEC和RMSECV變小、因子數(shù)變少，說明經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理的模型都較原始數(shù)據(jù)的好，和留一模型一樣，一階導(dǎo)數(shù)處理的內(nèi)部預(yù)測能力較好。

表3 留多法PLS模型參數(shù)Table 3 Parameters of the PLS model developed by the leave-more-out method

表4 驗證集的預(yù)測效果Table 4 Results of prediction with validation set

采用驗證集對原始數(shù)據(jù)、一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)模型進行驗證，結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后預(yù)測值與真實值的決定系數(shù)及RPD較原始數(shù)據(jù)增大，說明經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后預(yù)測值與真實值之間的整體方差較小，相對原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性均有所提高。一階導(dǎo)數(shù)處理后模型的預(yù)測效果比二階導(dǎo)數(shù)略好，一階導(dǎo)數(shù)處理后預(yù)測值相對偏差在20%以內(nèi)的比例占90.78%，在10%以內(nèi)的比例占81.56%，二階導(dǎo)數(shù)處理后預(yù)測值相對偏差在20%以內(nèi)的比例占91.49%，在10%以內(nèi)的比例占75.18%。說明一階導(dǎo)數(shù)處理的模型預(yù)測值多數(shù)較密集地分布在直線左右，說明預(yù)測值更準(zhǔn)確。

圖3 預(yù)測值與真值相關(guān)性比較Fig. 3 Correlation between predicted and true values

由圖3可知，一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)點較均勻地分散在直線兩側(cè)，而原始數(shù)據(jù)則是離散地分布在直線兩側(cè)，且多數(shù)偏離直線較遠(yuǎn)。一階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)點多數(shù)離直線較緊密，少數(shù)離直線較遠(yuǎn)，二階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)點較均勻地分散在直線附近，比一階導(dǎo)數(shù)整體分散，原始數(shù)據(jù)及RP2明顯反映出其整體方差較大。幾個模型的截距都較大，反映預(yù)測值與真實值的相對偏差較大。

3 結(jié)論與討論

衰減全反射傅里葉變換中紅外光譜結(jié)合PLS法建立大米硒代甲硫氨酸硒定量分析模型。作為一種快速、準(zhǔn)確的定量檢測方法，選擇1 600～650 cm-1作為特征波段，經(jīng)導(dǎo)數(shù)處理后建模，預(yù)測值與真實值的線性擬合決定系數(shù)能達(dá)到0.98以上，預(yù)測與真實值的相對偏差在20%以內(nèi)的高達(dá)90%以上，預(yù)測效果達(dá)到定量分析要求。

留一和留多模型都說明PLS法能較準(zhǔn)確地提取因子并擬合出極好的預(yù)測模型，留一模型一階導(dǎo)數(shù)處理RC2大于0.997 7，RMSEC為1.76～1.90，RMSECV為3.21～3.37，因子數(shù)為6；留多模型一階導(dǎo)數(shù)處理RC2大于0.998 4，RMSEC為1.52～1.54，RMSECV為3.55～3.71，因子數(shù)為6。說明留一法建模模型較優(yōu)，顯示出漸進無偏估計的優(yōu)勢性。外部驗證結(jié)果表明，留一和留多驗證預(yù)測效果都能達(dá)到分析要求，比較而言，留一法建模，預(yù)測效果更好。因為留一模型訓(xùn)練集較大，預(yù)測總體偏差較小，相對偏差在20%以內(nèi)的比例為92.91%，10%以內(nèi)占82.27%，留多模型則相對偏差在20%以內(nèi)的比例為90.78%，在10%以內(nèi)的比例為81.56%。

紅外光譜技術(shù)在食品檢測中已得到大量應(yīng)用，如產(chǎn)地鑒別[25-27]、品種鑒別[28-29]、偽劣鑒別[30-33]等定性分析方面有較多的研究應(yīng)用，且鑒別率高達(dá)80%～100%。在定量分析方面也有成功報道。Mauer等[34]采用中紅外和近紅外光譜可以用于液態(tài)奶、嬰兒配方奶粉和奶粉分析的快速、靈敏、穩(wěn)健且成本低；Roman等[35]分別用中紅外漫反射和衰減全反射、近紅外漫反射光譜建立PLS模型定量分析嬰兒配方粉中的三聚氰胺，結(jié)果表明均能夠快速檢測嬰兒配方奶粉中0.1 mg/kg三聚氰胺；方娟娟等[36]利用近紅外透射光譜結(jié)PLS法建立食醋中的總酸和苯甲酸的定量分析方法；Revelou等[37]采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜和PLS法測定西蘭花中異硫氰酸酯總含量。雖然以上研究表明中紅外光譜和近紅外光譜都能用于定量分析，但是下述研究表明，中紅外定量化學(xué)成分優(yōu)于近紅外法。Dupuy等[38]同時使用近紅外和中紅外光譜對橄欖油中的脂肪酸和甘油三酯采用PLS法建模進行定量分析，預(yù)測結(jié)果表明，中紅外方法更好。Baranska等[39]測定番茄果實和相關(guān)產(chǎn)品中番茄紅素和β-胡蘿卜素含量的測定，用矢量歸一化和基線校正處理數(shù)據(jù)，用PLS建模，結(jié)果表明近紅外測定效果比中紅外和拉曼實驗效果差。因此有必要采用多種光區(qū)和多種方法優(yōu)化紅外定量分析技術(shù)，使其方法更簡便、成本更低廉、結(jié)果更穩(wěn)定。

衰減全反射傅里葉變換中紅外光譜定量分析米粉中硒代甲硫氨酸中硒含量，方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種快速、準(zhǔn)確、實用、經(jīng)濟型的檢測方法，易于推廣使用，是一項值得深入研究和廣泛應(yīng)用的方法。