李 新，鄭兆娟，岳泰穩(wěn)，歐陽(yáng)嘉*

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

木質(zhì)纖維原料是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源，是制備生物燃料和生物基化學(xué)品的首選原料[1-3]。由于其結(jié)構(gòu)頑固性，需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理和酶水解才能得到微生物可以利用的可發(fā)酵性糖[4-5]。其中，纖維二糖是纖維素酶水解纖維素時(shí)的主要產(chǎn)物。由于絕大多數(shù)微生物不能直接利用纖維二糖，需要外源添加β-葡萄糖苷酶進(jìn)一步水解纖維二糖為葡萄糖，這進(jìn)一步增加了酶制劑成本。此外，纖維二糖是纖維素酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，強(qiáng)烈抑制纖維素酶的水解作用，極大地影響了同步糖化發(fā)酵效率[6-8]。因此，近年來(lái)，研究人員致力于開(kāi)發(fā)能利用纖維二糖的微生物生產(chǎn)各種高附加值化學(xué)品。例如，Adachi等[9]通過(guò)將β-葡萄糖苷酶展示在谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞表面，使得谷氨酸棒桿菌具備纖維二糖水解能力，實(shí)現(xiàn)了纖維二糖至L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。Mu?oz-Gutiérrez等[10]使用屬于V型分泌系統(tǒng)的自動(dòng)展示系統(tǒng)AIDA-I，在產(chǎn)乙醇的大腸桿菌菌株MS04的外膜上展示來(lái)自嗜熱放線菌的β-葡萄糖苷酶，以纖維二糖為底物，乙醇產(chǎn)率達(dá)到了理論最大值的81%。Soma等[11]通過(guò)將異丙醇合成途徑導(dǎo)入到大腸桿菌，并在大腸桿菌外膜上展示β-葡萄糖苷酶，證實(shí)了利用大腸桿菌發(fā)酵纖維二糖生產(chǎn)異丙醇的可行性。

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷鍵結(jié)合的非還原性雙糖，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物體內(nèi)。海藻糖不僅可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分和能量物質(zhì)，而且在氧化或干燥等極端條件下對(duì)生物體和生物大分子具有非特異性保護(hù)作用。海藻糖在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)和制藥工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景[12-13]。例如，海藻糖可用于疫苗的穩(wěn)定和器官的保存[14-15]。Martinetti等[16]建立了一種使用海藻糖冷凍保存純的外周血干細(xì)胞的方法，與正常冷凍保存手段相比，該方法提高了解凍后的細(xì)胞存活率。Vílchez等[17]篩選了一系列微生物作為耐干燥保護(hù)劑以保護(hù)植物免受干旱的影響，研究發(fā)現(xiàn)這些微生物產(chǎn)生的海藻糖是保護(hù)植物免受干旱的重要物質(zhì)。隨著市場(chǎng)對(duì)海藻糖的需求不斷增大，研究人員也在不斷開(kāi)發(fā)合成海藻糖的新方法。生物體內(nèi)研究最多的海藻糖合成途徑主要有三條：一是OtsAB途徑，該途徑以葡萄糖為底物，通過(guò)6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶催化形成海藻糖[18-19]；二是TreYZ途徑，該途徑以麥芽糊精為底物，通過(guò)麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶催化形成海藻糖[20]；三是TreS途徑，該途徑以麥芽糖為底物，通過(guò)海藻糖合酶催化形成海藻糖[21]。

假單胞菌是一種條件致病菌，其可以利用多種不同的策略抵抗干旱等惡劣環(huán)境，其中的一種策略就是在細(xì)胞內(nèi)合成海藻糖[22-23]。Zheng Zhaojuan等[21]克隆了施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501來(lái)源的treS基因，并在大腸桿菌（Escherichia coli）中重組表達(dá)，全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)表明該重組菌株具有高效轉(zhuǎn)化麥芽糖為海藻糖的能力?；蚪M分析表明，P.stutzeriA1501基因組上還具備海藻糖合成的OtsAB途徑和TreYZ途徑。本研究克隆了來(lái)自P. stutzeriA1501的otsAB基因，外源導(dǎo)入E. coliBL21（DE3）構(gòu)建合成海藻糖的OtsAB途徑。并通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)自大腸桿菌的尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU來(lái)強(qiáng)化合成海藻糖的OtsAB途徑。在此基礎(chǔ)上，引入來(lái)自1 株天然纖維素分解細(xì)菌Saccharophagus degradans的纖維二糖磷酸化酶基因cepA，使大腸桿菌具備纖維二糖代謝能力。重組大腸桿菌以纖維二糖為底物合成海藻糖的代謝途徑如圖1所示。最后，本研究探討了該重組大腸桿菌以纖維二糖為底物全細(xì)胞催化合成海藻糖的可行性，為纖維二糖來(lái)源精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)提供了新的思路。

圖1 重組大腸桿菌纖維二糖合成海藻糖的途徑Fig. 1 Biosynthesis pathway of trehalose from cellobiose in recombinant E. coli

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

本研究所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增所用引物序列見(jiàn)表2。其中纖維二糖磷酸化酶基因cepA（GenBank NC_007912，范圍：1710240～1712675）按照大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表2 本研究使用的PCR擴(kuò)增引物Table 2 Sequences of PCR primers used in this study

1.1.2 酶與試劑

PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶TaKaRa（大連）公司；酵母提取物、胰蛋白胨 德國(guó)Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素鈉、硫酸卡那霉素、井岡霉素 生工生物工程（上海）股份有限公司；基因組提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 上海捷瑞生物工程公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；引物由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

MasterCycler Gradient 5331梯度PCR儀、5415R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppebdorf公司；DYY-8B核酸電泳儀、GIS system凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；752S型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；ICS·3000型離子色譜儀 美國(guó)Dionex公司；MSC1.2無(wú)菌操作臺(tái) 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆

DNA酶切、連接、感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化、基因組提取等基本基因操作技術(shù)參照文獻(xiàn)[24]及供應(yīng)商提供的操作手冊(cè)進(jìn)行。

質(zhì)粒pETDuet-otsA-otsB構(gòu)建：參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的P. stutzeriA1501的otsA基因序列（GenBank NC_009434，范圍：3495671～3497086）和otsB基因序列（GenBank NC_009434，范圍：3497103～3497879），使用引物otsA-F、otsA-R擴(kuò)增otsA基因插入質(zhì)粒pETDuet-1的BamHI、HindIII位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-otsA。然后再使用引物otsB-F、otsB-R擴(kuò)增otsB基因插入質(zhì)粒pETDuet-otsA的NdeI、XhoI位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pETDuetotsA-otsB，測(cè)序驗(yàn)證。

質(zhì)粒pRSFDuet-galU-cepA的構(gòu)建：參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的E. coliBL21的galU基因序列（GenBank NC_012892，范圍：1279243～1280151），使用引物galU-F、galU-R擴(kuò)增galU基因插入質(zhì)粒pRSFDuet-1的BamHI、HindIII位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pRSFDuet-galU。然后參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的S. degradans2-40的cepA基因序列（GenBank NC_007912，范圍：1710240～1712675），對(duì)cepA基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，送去上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用引物cepA-F、cepA-R擴(kuò)增合成的cepA基因插入質(zhì)粒pRSFDuetgalU的BglII、XhoI位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pRSFDuet-galU-cepA，測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：Na2HPO4·12 H2O 19.100 8 g/L，KH2PO41.815 6 g/L。

大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)根據(jù)需要加入終質(zhì)量濃度為100 mg/L的氨芐青霉素鈉或40 mg/L的硫酸卡那霉素。

1.3.3 重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成海藻糖

1.3.3.1 菌種活化

將保存于-80 ℃的菌種接入裝有5 mL LB的搖管中，接種量1%，并根據(jù)需要加入終質(zhì)量濃度100 mg/L氨芐青霉素鈉，40 mg/L硫酸卡那霉素，放置于37 ℃、200 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.3.2 擴(kuò)培和誘導(dǎo)

將活化好的菌種轉(zhuǎn)入裝有1/5裝液量的500 mL的三角搖瓶中，接種量1%，并根據(jù)需要加入終質(zhì)量濃度100 mg/L氨芐青霉素鈉、40 mg/L硫酸卡那霉素，放置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入終濃度1 mmol/L的IPTG，轉(zhuǎn)移到30 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h。8 000 r/min離心收集誘導(dǎo)好的菌體，用PBS洗滌菌體2 遍，重懸于PBS中備用。

1.3.3.3 全細(xì)胞催化

全細(xì)胞催化在150 mL的錐形瓶中進(jìn)行，裝有10 mL催化反應(yīng)混合液，混合液中的菌體OD600nm為20，葡萄糖或纖維二糖質(zhì)量濃度為20 g/L，并根據(jù)需要加入終濃度0.05 mmol/L井岡霉素。反應(yīng)在30 ℃、200 r/min的條件下進(jìn)行，定時(shí)取樣測(cè)定底物和產(chǎn)物濃度。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè)

菌體密度測(cè)定采用比濁法。將培養(yǎng)液用水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，使OD600nm值在0.6～1.0之間，進(jìn)行濁度測(cè)定。測(cè)定條件：采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，波長(zhǎng)600 nm。

葡萄糖、纖維二糖、海藻糖質(zhì)量濃度測(cè)用采用離子色譜法[25]。取1 mL反應(yīng)混合液，室溫下12 000 r/min離心2 min，取上清液，用孔徑為0.22 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾。分析條件：采用離子色譜儀，分析柱為CarboPacTM10（250 mm×2 mm）；檢測(cè)方式：四電位脈沖安培檢測(cè)。以超純水、200 mmol/L NaOH（A）和500 mmol/L NaAc（B）為淋洗液進(jìn)行洗脫。0～7.00 min，采用75%超純水和25% A相混合液淋洗，7.01～10 min變?yōu)?00% A相，然后A相線性減少，B相線性增加，至15.00 min時(shí)，變?yōu)?0% A相和10% B相混合液；15.01～30 min恢復(fù)為75%超純水和25% A相沖洗系統(tǒng)。進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算各物質(zhì)的含量。數(shù)據(jù)測(cè)定后取平均值，本研究中誤差線代表3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 otsA、otsB、galU和cepA基因克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2 otsA、otsB、galU和cepA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoretograms of PCR-amplified otsA, otsB, galU and cepA

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-otsA-otsB、 pRSFDuet-galU和pRSFDuet-galU-cepA雙酶切驗(yàn)證Fig. 3 Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pETDuet-otsA-otsB, pRSFDuet-galU and pRSFDuet-galU-cepA

提取P. stutzeriA1501的基因組，以其為模板分別PCR擴(kuò)增得到otsA和otsB基因，按照1.3.1節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法將其連接至pETDuet-1表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pETDuetotsA-otsB并送至安徽通用生物有限公司測(cè)序。提取E. coliBL21的基因組，以其為模板PCR擴(kuò)增得到galU基因，按照1.3.1節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法將其連接至pRSFDuet-1表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pRSFDuet-galU并送至安徽通用生物有限公司測(cè)序。cepA基因由上海捷瑞生物工程有限公司按照大腸桿菌密碼子優(yōu)化后序列合成，之后以其合成基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照1.3.1節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法將其連接至pRSFDuet-galU，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pRSFDuetgalU-cepA并送至安徽通用生物有限公司測(cè)序。otsA、otsB、galU和cepA基因的PCR擴(kuò)增如圖2所示。瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序結(jié)果均表明，otsA基因長(zhǎng)度為1 416 bp，otsB基因長(zhǎng)度為777 bp，galU基因長(zhǎng)度為909 bp，cepA基因長(zhǎng)度為2 436 bp，其中otsA、otsB和galU基因序列與NCBI公布序列大小相符，序列一致性為100%。cepA基因與密碼子優(yōu)化后的序列完全一致。重組表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-otsA-otsB、pRSFDuet-galU和pRSFDuet-galU-cepA雙酶切驗(yàn)證如圖3所示，otsA、otsB、galU和cepA基因均已成功連接。

2.2 以葡萄糖為底物全細(xì)胞催化合成海藻糖

雖然有報(bào)道表明大腸桿菌具備海藻糖合成的OtsAB途徑[26]，但可能由于該途徑太弱，無(wú)法檢測(cè)到海藻糖產(chǎn)量。因此本研究克隆了來(lái)自P. stutzeriA1501的otsAB基因，在E. coliBL21（DE3）內(nèi)重構(gòu)了一條合成海藻糖的途徑。OtsAB途徑合成海藻糖的前體物質(zhì)是葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖（圖1），由于菌體細(xì)胞自身合成的UDP-葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)積累水平較低，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)表達(dá)大腸桿菌內(nèi)參與UDP-葡萄糖合成的關(guān)鍵酶UDP-葡萄糖焦磷酸化酶來(lái)提高重組菌株細(xì)胞內(nèi)的UDP-葡萄糖水平。以葡萄糖為底物全細(xì)胞催化合成海藻糖，比較出發(fā)菌株E. coliBL21（DE3）和重組菌株E. coliBL21（A），E. coliBL21（C）利用葡萄糖合成海藻糖的能力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 對(duì)照菌與重組菌全細(xì)胞催化合成海藻糖的過(guò)程分析Fig. 4 Time course of trehalose synthesis catalyzed by whole control and recombinant cells

從圖4可以看出，出發(fā)菌株E. coli BL21（DE3）不能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。重組菌株E. coli BL21（A）可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，海藻糖產(chǎn)量在8 h達(dá)到最高值0.25 g/L左右，這說(shuō)明外源otsA/otsB基因可在大腸桿菌中成功表達(dá)并發(fā)揮功能。與E. coli BL21（A）相比，重組菌株E. coli BL21（C）轉(zhuǎn)化葡萄糖為海藻糖的能力大幅提高，海藻糖的產(chǎn)量在24 h達(dá)到0.75 g/L左右。過(guò)表達(dá)來(lái)自大腸桿菌的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶后，雖然葡萄糖利用速率減慢，但是增加了海藻糖合成前體UDP-葡萄糖的含量，海藻糖的產(chǎn)量提高了3 倍左右。

2.3 井岡霉素對(duì)海藻糖合成的影響

大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)含有降解海藻糖的酶，即海藻糖酶，可以分解海藻糖為兩分子葡萄糖[27]，從圖4可以看出，海藻糖產(chǎn)量在達(dá)到一定程度后開(kāi)始下降，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了海藻糖酶的存在。據(jù)報(bào)道[28]，井岡霉素可以降低海藻糖酶的活性，抑制海藻糖在菌體內(nèi)的降解。為進(jìn)一步提高海藻糖的產(chǎn)量，在添加井岡霉素的條件下，以葡萄糖為底物全細(xì)胞催化合成海藻糖，比較重組菌株E. coli BL21（A），E. coli BL21（C）合成海藻糖的能力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 井岡霉素對(duì)重組菌全細(xì)胞催化合成海藻糖的影響Fig. 5 Effect of validamycin A on the synthesis of trehalose

由圖5可以看出，隨著底物葡萄糖的不斷消耗，海藻糖也在不斷積累，E. coli BL21（A）轉(zhuǎn)化葡萄糖生成海藻糖的產(chǎn)量在36 h達(dá)到0.68 g/L左右，E. coli BL21（C）轉(zhuǎn)化葡萄糖生成海藻糖的產(chǎn)量在36 h達(dá)到1.1 g/L左右。同時(shí)，由圖4和圖5對(duì)比可以看出，加入井岡霉素后，海藻糖的產(chǎn)量得到明顯提高，并且維持在一定的水平不再下降。

2.4 以纖維二糖為底物全細(xì)胞催化合成海藻糖

據(jù)Sekar等[29]報(bào)道，S. degradans 2-40是一株天然纖維素分解細(xì)菌，可依靠cepA基因?qū)⒗w維二糖磷酸解為葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸。因此，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在重組菌株E. coli BL21（C）胞內(nèi)進(jìn)一步過(guò)表達(dá)cepA基因，以期實(shí)現(xiàn)纖維二糖至海藻糖的合成通路。在添加井岡霉素的條件下，以纖維二糖為底物全細(xì)胞催化合成海藻糖，比較重組菌株E. coli BL21（C）和重組菌株E. coli BL21（D）利用纖維二糖合成海藻糖的能力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 以纖維二糖為底物合成海藻糖的過(guò)程曲線Fig. 6 Time course of trehalose synthesis from cellobiose

由圖6可以看出，重組菌株E. coli BL21（C）不能將纖維二糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，重組菌株E. coli BL21（D）可以將纖維二糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，海藻糖的產(chǎn)量在48 h達(dá)到最高值1.3 g/L左右，這是以纖維二糖為底物合成海藻糖的首次報(bào)道。但是，由于大腸桿菌糖酵解途徑的存在，使得大量葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入糖酵解途徑被消耗，這導(dǎo)致海藻糖合成的前體物質(zhì)大為減少（圖1），因此下一步應(yīng)該采取合適的代謝工程策略，在不影響菌株存活的前提下，增加纖維二糖至海藻糖的代謝流量。

目前，海藻糖的生產(chǎn)方法主要是酶合成法和微生物發(fā)酵法。依賴于麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的酶法合成途徑是最早建立的規(guī)?；Ｔ逄巧a(chǎn)方法，但該方法生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，無(wú)法滿足市場(chǎng)對(duì)海藻糖的大量需求[30]。微生物發(fā)酵法主要是以篩選的野生型菌株、過(guò)表達(dá)6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶或者過(guò)表達(dá)海藻糖合酶的基因工程菌株作為生物催化劑，以生長(zhǎng)體系或者全細(xì)胞催化體系實(shí)現(xiàn)海藻糖的合成[19]。其中海藻糖合酶的優(yōu)點(diǎn)是只需要一步反應(yīng)即可以實(shí)現(xiàn)麥芽糖至海藻糖的轉(zhuǎn)化，缺點(diǎn)是海藻糖合酶具有一定的麥芽糖水解活性，該反應(yīng)常伴有副產(chǎn)物葡萄糖的產(chǎn)生[21]。依賴于6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶的OtsAB途徑在自然界分布最為廣泛，是研究最多的一種胞內(nèi)合成海藻糖的方式。微生物利用OtsAB途徑合成海藻糖的底物為葡萄糖，近年來(lái)，研究者開(kāi)發(fā)了多種不同的底物通過(guò)OtsAB途徑實(shí)現(xiàn)了海藻糖的合成。例如，Li He等[28]通過(guò)在E. coli MG1655過(guò)表達(dá)來(lái)自E. coli DH5α的OtsAB途徑，以甘油為底物實(shí)現(xiàn)了海藻糖的生產(chǎn)。Habe等[31]通過(guò)利用篩選的Burkholderia stabilis LA20W為出發(fā)菌株，以乙酰丙酸為底物合成了海藻糖。Kar等[32]利用專性嗜鹽菌Actinopolyspora halophile MTCC 263為出發(fā)菌株，以酸乳清為底物合成了海藻糖。本研究構(gòu)建了以纖維二糖為底物合成海藻糖的途徑，這為以木質(zhì)纖維原料為底物合成海藻糖提供了研究基礎(chǔ)。但是，和其他利用OtsAB途徑合成海藻糖的菌株一樣，海藻糖的產(chǎn)量不高，后續(xù)工作中需要結(jié)合代謝工程手段敲除支路途徑以提高海藻糖的產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

本研究克隆了來(lái)自P. stutzeri A1501的otsA/otsB基因，成功構(gòu)建用于海藻糖生產(chǎn)的重組大腸桿菌。通過(guò)增加海藻糖合成前體物質(zhì)的含量和抑制海藻糖的降解，進(jìn)一步提高海藻糖的產(chǎn)量。UDP-葡萄糖是合成海藻糖的前體物質(zhì)之一，它是提高海藻糖產(chǎn)量的限制因素之一，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提高胞內(nèi)UDP-葡萄糖水平，使海藻糖的產(chǎn)量提高了3 倍。同時(shí)，菌體內(nèi)還有降解海藻糖的酶系，通過(guò)添加一定濃度的井岡霉素抑制海藻糖酶的活性，進(jìn)一步使提高海藻糖產(chǎn)量。最后，為實(shí)現(xiàn)菌株對(duì)纖維二糖的利用，在前期改造的菌株中進(jìn)一步過(guò)表達(dá)了纖維二糖磷酸化酶基因，使重組大腸桿菌具有利用纖維二糖產(chǎn)海藻糖的能力，最高產(chǎn)量為1.3 g/L。