牛瀟迪，李天明，劉金雷，楊天勇，李子怡，馮惠勇,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.馬里蘭大學(xué)帕克分校文理科學(xué)學(xué)院，美國 馬里蘭 20742）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是食品級GRAS（generally regarded as safe）微生物，是釀造業(yè)、焙烤業(yè)廣泛使用的微生物，也是重組蛋白高效表達的理想宿主菌之一。另外，由于其具有魯棒性好、細胞量大、在低pH值條件（甚至pH值小于3.0）下生長良好、能耐受高濃度的底物和發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性等優(yōu)點，作為“細胞工廠”的底盤細胞，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、有機酸、飼料添加劑等生產(chǎn)[1-5]?；蚪M改造是提高生產(chǎn)性能的有效途徑。常規(guī)的S. cerevisiae的基因改造方法是采用Cre-loxP系統(tǒng)[6]，該方法利用同源重組機制采用抗生素或者營養(yǎng)缺陷型進行篩選，一般一次只能進行單個基因的刪除；由于適用于S. cerevisiae的抗生素和營養(yǎng)缺陷型種類數(shù)量的限制，當進行多個基因刪除時，還要進行第二次轉(zhuǎn)化，借助Cre-loxP系統(tǒng)去除篩選標記后，才能進行；因此此方法在打靶效率、操作簡便性及工作效率等方面，都有待改進提高。近年來，迅速發(fā)展完善的CRISPRCas9基因編輯技術(shù)，可以依靠向?qū)NA（guide RNA，gRNA）識別目標序列，利用Cas9蛋白切割序列[7-11]，實施靶位點特異性切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，激發(fā)細胞同源重組修復(fù)機制或者非同源末端連接修復(fù)機制，無需利用篩選標記，就可實現(xiàn)高效的基因組的定點敲除、定點敲入和基因修飾[12-13]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)相較于重組鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）技術(shù)[14]和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）基因編輯技術(shù)，有操作簡單[15-17]、設(shè)計靈活、價格低廉、能實現(xiàn)多點編輯、可擴展性強等優(yōu)點[18-20]。Church[20]和Bao Zehua[21]等先后報道了利用CRISPR-Cas9進行S. cerevisiae單倍體細胞基因組編輯的方法，但是利用該方法對S. cerevisiae雙倍體細胞進行高效基因組編輯的方法還鮮見報道。

本研究通過構(gòu)建Cas9和gRNA的表達質(zhì)粒，在S. cerevisiae雙倍體細胞中建立了CRISPR-Cas9系統(tǒng)，借助供體DNA（donor DNA）[22-24]，實現(xiàn)了can1、pdc、adh3、adh2、adh1、pdc等多個單基因的高效敲除；建立了基因連續(xù)敲除和兩個以上基因同時敲除的方法和程序；為在S. cerevisiae中進行大規(guī)模的基因編輯提供了方法學(xué)基礎(chǔ)，同時也為CRISPR-Cas9技術(shù)在其他工業(yè)微生物中的應(yīng)用提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實驗所用的菌株、質(zhì)粒分別如表1所示。

表1 本實驗所用的菌株、質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

續(xù)表1

1.1.2 引物與試劑

本實驗所用引物如表2所示。

表2 本實驗所用引物Table 2 PCR primers used in this study

構(gòu)建及驗證所用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；FastPfuDNA聚合酶、High Fidelity DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI、SacI、NotI NEB（北京）公司；T4 DNA ligse 大連寶生物工程公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒和基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

轉(zhuǎn)化過程中用到10×TE、1×TE、10×LiAc、1×LiAc（0.1 mol/L)，1×LiAc/0.5×TE為10 mL 10×LiAc和5 mL 10×TE用去離子水定容100 mL，1×LiAc/40%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）3350/1×TE（現(xiàn)用現(xiàn)混）為100 μL 10×LiAc+100 μL 10×TE+800 μL 50% PEG3350混合。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，調(diào)pH值為7.4左右，需要時加入卡那霉素至終質(zhì)量濃度0.05g/L。固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉至20 g/L。

SOC（super optimal broth with catabolite repression）培養(yǎng)基：2 g/100 mL胰蛋白胨、0.5 g/100 mL酵母粉、0.05 g/100 mL氯化鈉、2.5 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L氯化鎂、20 mmol/L葡萄糖。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1 g/100 mL酵母膏、2 g/100 mL 蛋白胨、2 g/100 mL葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基，加入2 g/100 mL瓊脂粉。

選擇（synthetic dropout，SD）培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）培養(yǎng)基（成分見Solarbio YNB培養(yǎng)基產(chǎn)品介紹）6.7 g，另取葡萄糖5 g加熱溶解于100 mL蒸餾水中，制成10 倍溶液，過濾除菌。使用時，取0.5 mL 10 倍溶液加入4.5 mL無菌蒸餾水中，備用。根據(jù)不同的篩選標記添加不同的氨基酸。

1.2 儀器與設(shè)備

Finnpipette移液槍 美國Thermo公司；SW-CJ型超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；PCR儀 美國Bio-Rad公司；Jl003A型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；HWS型培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；F1-F2凝膠成像儀上海天能科技有限公司；Neofuge23R冷凍離心機 力新儀器（上海）有限公司；pH211酸度計 意大利Hanna公司；HYG型搖床 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；PoweWave HT酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；DZKW-D水浴鍋 河北黃驊航天儀器廠；BCD-191W/HC冰箱 上海海爾股份有限公司；G80W23YCsL-03（RO）微波爐 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

本研究所用的S. cerevisiae菌株為4 種氨基酸缺陷的雙倍體菌株，缺陷型為Trp-、Leu-、Ura-、His-。親本S. cerevisiae菌株Δura3Δtrp1Δleu2Δhis3（下文均稱為WT）轉(zhuǎn)化前在YPD培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后的篩選培養(yǎng)基采用缺乏相應(yīng)質(zhì)粒的篩選標記的篩選培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。

1.3.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建

圖1 pRS424-TRP-cas9構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic illustration of construction of pRS424-TRP-cas9

CRISPR-Cas9系統(tǒng)需要Cas9核酸酶和gRNA的共同作用才能發(fā)揮基因編輯作用，需要構(gòu)建一個能夠表達cas9的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進酵母菌中使其表達Cas9核酸酶[25-30]。表達Cas9核酸酶的質(zhì)粒構(gòu)建方法如下：首先以實驗室保存質(zhì)粒pMD18-cas9為模板，通過引物cas9-F、cas9-R利用PCR技術(shù)擴增出cas9基因片段；以S. cerevisiae288c野生型菌株基因組為模板，通過引物cas9-tef-F、cas9-tef-R利用PCR技術(shù)擴增出tef啟動子；以S. cerevisiae288c野生型菌株基因組為模板，通過引物cas9-cyc-F、cas9-cyc-R利用PCR技術(shù)擴增出cyc1終止子。為使在細胞質(zhì)中表達的Cas9蛋白質(zhì)能夠透過核膜到達細胞核內(nèi)參與DNA剪切，在Cas9表達質(zhì)粒中添加一段表達核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的基因序列，通過在tef啟動子基礎(chǔ)上利用延伸PCR擴增得到，將所得片段利用Overlapping PCR技術(shù)融合得到目的片段，凝膠純化目的片段后與pRS424-TRP空質(zhì)粒利用KpnI和XhoI進行雙酶切，目的片段與pRS424-TRP空質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物通過超薄DNA產(chǎn)物回收試劑盒回收，利用T4連接酶過夜連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTransT1感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證后獲得Cas9表達質(zhì)粒pRS424-TRP-cas9。構(gòu)建示意圖如圖1所示。質(zhì)粒pRS424-TRP帶有色氨酸（Trp）表達基因，WT為Δura3Δtrp1Δleu2Δhis3基因缺陷型，將pRS424-TRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進WT細胞后，可利用Trp營養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)基篩選。

被敲除基因的靶位點gRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建及其donor DNA的設(shè)計：以敲除can1基因的打靶質(zhì)粒為例，參照NCBI中S. cerevisiae模式菌株S. cerevisiae288c的基因組信息，選取編碼精氨酸透酶的基因can1為靶點基因，利用軟件找到cas9可以識別的間隔序列前體旁基序（protospacer adjacent motif，PAM）位點（5-NGG或NAG結(jié)構(gòu)），通過引物can1-gRNA-1F、can1-gRNA-1R利用PCR擴增出SNR52啟動子、HINDLE，通過引物can1-gRNA-2F、can1-gRNA-2R利用PCR擴增出SUP43FLANK，利用Overlapping PCR技術(shù)融合啟動子SNR52、20 nt can1靶點序列、HINDLE及SUP43FLANK，將所得片段純化后與pESCG-LEU質(zhì)粒骨架利用SacI和NotI進行雙酶切，目的片段與pESCGLEU空質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物通過超薄DNA產(chǎn)物回收試劑盒回收，利用T4連接酶過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TransT1感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證后獲得打靶質(zhì)粒pESCG-LEU-gRNA-can1。構(gòu)建示意圖如圖2所示。

圖2 pESCG-LEU-gRNA-can1構(gòu)建示意圖Fig. 2 Schematic illustration of construction of pESCG-LEU-gRNA-can1

設(shè)計引物融合靶位點上下游的一段同源序列，以S.cerevisiae 288c基因組為模板，通過PCR技術(shù)擴增出donor DNA。構(gòu)建示意圖如圖3所示。

本實驗還成功敲除了adh1、adh2、adh3、pdc、pdh等多個基因，其打靶質(zhì)粒詳見表1。本實驗所用的菌株、質(zhì)粒。打靶質(zhì)粒的構(gòu)建方法和donor DNA的構(gòu)建方法與前文所述類似，此外，一次轉(zhuǎn)化兩個打靶質(zhì)粒pRS423-HIS-gRNA-qadh5及pESCG-LEU-gRNA-lip的構(gòu)建方法和donor DNA的構(gòu)建方法也與之類似。

圖3 donor DNA構(gòu)建示意圖Fig. 3 Schematic illustration of construction of donor DNA

1.3.3 S. cerevisiae感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

S. cerevisiae感受態(tài)的制備方法參考文獻[31]酵母高效轉(zhuǎn)化，稍作修改。將過夜培養(yǎng)的菌株WT以10%體積比接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)3～4 h，當OD600nm達到0.5～1時，利用冷凍離心機在4 ℃條件下收集菌體，棄去上清液，加1 mL 1×TE重懸，棄去上清液，30 μL 1×LiAc/0.5×TE重懸，之后室溫靜置10 min，加入1 μg pRS424-TRP-cas9，1 μg打靶質(zhì)粒，10 μL donor DNA和10 μL ss-DNA，加入250 μL 1×LiAc/40% PEG3350/1×TE，混合均勻，30 ℃孵育30 min，加入30 μL二甲基亞砜，混合均勻，42 ℃熱擊7 min，4 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入1 mL 1×TE重懸漂洗，最后離心收集菌體涂布篩選平板。30 ℃培養(yǎng)約72 h后，挑選固體培養(yǎng)基平板上長出的第3批較小的單菌落進行篩選驗證。

1.3.4 can1靶點的篩選驗證

由于can1基因編碼一種質(zhì)膜精氨酸（Arg）通透酶，所以在敲除can1基因的實驗中，將轉(zhuǎn)化進打靶質(zhì)粒的酵母感受態(tài)涂布在添加精氨酸的培養(yǎng)基上。待長出轉(zhuǎn)化子后挑取單菌落影印在含有刀豆素（一種有毒精氨酸類似物）和不含刀豆素的培養(yǎng)基上，若can1基因被敲除，則菌在刀豆板上生長，若沒有敲除can1基因，則菌在刀豆板上不長。由此可以挑選出正確的轉(zhuǎn)化子。

之后設(shè)計驗證引物進行分子驗證，敲除基因不能擴增出來，敲入基因能擴增出來的為陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.5 其他基因敲除的篩選驗證

挑選培養(yǎng)72 h后第3批長出的較小的菌落擴菌到相同篩選標記的固體培養(yǎng)基平板上，第2天振蕩裂解進行菌落PCR驗證，確認打靶細胞經(jīng)過同源重組正確地整合到宿主細胞中。將驗證正確的菌株再次擴菌，提取基因組進一步驗證確認。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

基因敲除效率的計算方法：將PCR驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子的個數(shù)與所有被驗證轉(zhuǎn)化子的比例作為這一基因的敲除效率。凝膠成像圖利用visio軟件處理并標注。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建

2.1.1 pRS424-TRP-cas9質(zhì)粒的構(gòu)建

以pMD18-cas9的基因組為模板經(jīng)PCR擴增出cas9基因片段；以S. cerevisiae 288c野生型菌株基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴增出tef啟動子，cyc1終止子，NLS在tef啟動子基礎(chǔ)上通過延伸PCR擴增得到，利用Overlapping PCR技術(shù)融合得到目的片段，將目的片段與空質(zhì)粒pRS424-TRP雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到E. coli，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行酶切驗證，獲得5 616 bp載體片段和4 860 bp目的片段2 條條帶，結(jié)果如圖4所示，質(zhì)粒pRS424-TRP-cas9構(gòu)建成功。

圖4 pRS424-TRP-cas9酶切驗證Fig. 4 Identification of pRS424-TRP-cas9 by double enzymatic digestion

2.1.2can1基因gRNA打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

以S. cerevisiae288c基因組為模板，利用PCR擴增技術(shù)得到can1靶點基因、SNR52啟動子、HINDLE及SUP43FLANK，利用Overlapping PCR技術(shù)融合得到目的片段，將目的片段與空質(zhì)粒pESCG-LEU雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行酶切驗證，得到400 bp大小目的片段和7 200 bp大小載體片段，如圖5所示，質(zhì)粒pESCG-LEU-gRNA-can1構(gòu)建成功。

圖5 打靶質(zhì)粒pESCG-LEU-gRNA-can1酶切驗證Fig. 5 Identification of target plasmid pESCG-LEU-gRNA-can1 by double enzymatic digestion

donor DNA的構(gòu)建：以S. cerevisiae288c基因組為模板，通過引物融合靶位點上下游的一段同源序列，得到一段大小為1 450 bp的基因片段，凝膠回收備用。

2.2 can1靶點基因敲除的結(jié)果

將表達Cas9核酸酶的表達質(zhì)粒pRS424-TRP-cas9、打靶質(zhì)粒pESCG-LEU-gRNA-can1以及donor DNA共同轉(zhuǎn)化進S. cerevisiae感受態(tài)細胞內(nèi)，Cas9核酸酶與gRNA共同作用實現(xiàn)細胞體內(nèi)重組。將單菌落用0.9%生理鹽水稀釋，在含有刀豆素（CAN+）和不含刀豆素（CAN-）的培養(yǎng)基上影印，含刀豆的板上長的即為陽性轉(zhuǎn)化子。如圖6所示，統(tǒng)計得到陽性抗刀豆氨酸的突變子大約22%。將影印結(jié)果中陽性轉(zhuǎn)化子的對應(yīng)菌液振蕩裂解做PCR菌落驗證，根據(jù)待敲除基因can1以及donor DNA設(shè)計敲除驗證引物，驗證被敲除基因的引物為YZQCF/YZQCR，其中，F(xiàn)為被敲除基因的23 bp大小的基因序列（AGGATGGCATAGGTGATGAAGAT，GenBank號為NC_001133.9），R為下同源臂下游染色體27 bp大小基因序列（GCAGTGATACCAACTAGTTCAGTACCT，G e n B a n k號為N C_0 0 1 1 3 3.9）。驗證敲入基因的引物為Y Z Q R F/Y Z Q R R，其中F為d o n o r D N A中含有終止密碼子的2 1 b p序列（AATAACGGCAAACAGCAAAGG，GenBank號為NC_001133.9），R為下同源臂下游染色體27 bp大小基因序列（GCAGTGATACCAACTAGTTCAGTACCT，GenBank號為NC_001133.9）分別以can1-/WT菌株與WT菌株的基因組為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖7所示，敲除基因沒有擴增出來，敲入基因擴增出來，大小為750 bp為陽性轉(zhuǎn)化子，22 個中有4 個為基因編輯的轉(zhuǎn)化子。生理突變株和分子驗證的突變株數(shù)量不一致的原因，可能是S. cerevisiae為真核細胞，存在著非同源性末端接合，雖然沒有借助同源重組也得到了can1基因改變的突變株。

圖6 can1基因敲除影印結(jié)果Fig. 6 Photographic results of knocking-down can1 gene

圖7 can1缺失基因PCR驗證Fig. 7 Identification of can1 deletion by PCR

2.3 其他單基因敲除的結(jié)果

為驗證建立的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在S. cerevisiae中進行基因編輯的有效性，本研究分別構(gòu)建pdc、adh3、adh2、adh1、pdh基因gRNA的表達質(zhì)粒及相應(yīng)的打靶donor DNA（其他基因敲除表達質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果略）分別轉(zhuǎn)化S. cerevisiae感受態(tài)細胞，Cas9核酸酶與gRNA共同作用實現(xiàn)細胞基因編輯。待培養(yǎng)72 h后，挑取最小一批的單菌落擴菌，PCR驗證，匯總實驗結(jié)果，總體基因編輯效率如表3所示?；騪dc敲除效率為4/48；adh3敲除效率為3/48；adh2敲除效率為1/48；adh1敲除效率為3/28；pdh敲除效率為1/16。

表3 各基因敲除效率Table 3 Gene knockdown efficiency

2.4 基因連續(xù)敲除的結(jié)果

為在敲除掉某一個基因后能夠快速順利地敲除下一個基因，采用篩選標記交替使用的方法：敲除第1個基因的gRNA構(gòu)建在Leu作為篩選標記的質(zhì)粒上，第2個敲除的基因構(gòu)建在His作為篩選標記的質(zhì)粒上，第1個基因敲除后，使用添加第1種篩選標記的Leu的培養(yǎng)基，繼續(xù)進行第2個基因的敲除操作，這樣可以在進行敲除基因的同時，丟掉第1個基因的pESCG-LEU-gRNA質(zhì)粒，以便進行第3個基因敲除操作，這樣交替進行，提高了多個基因敲除的操作效率，簡化了操作步驟。連續(xù)基因敲除流程如圖8所示。采用上述方法，本研究在pdc基因敲除后，繼續(xù)敲除了adh3基因，又繼續(xù)敲除了adh2，敲除3 個基因整個操作過程為17 d。根據(jù)待敲除基因以及donor DNA設(shè)計敲除驗證引物，分別以待驗證的敲除基因菌株與WT菌株的基因組為模板，進行PCR驗證，第1個基因pdc敲除的驗證結(jié)果如圖9所示，敲入基因擴增出來，大小為560 bp為陽性轉(zhuǎn)化子；第2個基因adh3敲除的驗證結(jié)果如圖10所示，敲入基因擴增出來，大小為850 bp為陽性轉(zhuǎn)化子；第3個基因adh2敲除的驗證結(jié)果如圖11所示，敲除基因擴增不出來，敲入基因擴增出來，大小為570 bp為陽性轉(zhuǎn)化子。

圖8 連續(xù)基因敲除流程圖Fig. 8 Flow chart of sequential knockout

圖9 pdc缺失基因PCR驗證Fig. 9 Identification of pdc deletion by PCR

圖10 adh3缺失基因PCR驗證Fig. 10 Identi fi cation of adh3 deletion by PCR

圖11 adh2缺失基因PCR驗證Fig. 11 Identification of adh2 deletion by PCR

2.5 雙基因敲除的篩選驗證結(jié)果

為進一步提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因刪除效率，本研究將pRS424-TRP-cas9、gRNA表達質(zhì)粒pRS423-HIS-gRNA-adh5、pESCG-LEU-gRNA-lip以及donor DNA共同轉(zhuǎn)化進S. cerevisiae感受態(tài)細胞內(nèi)，Cas9核酸酶與gRNA共同作用實現(xiàn)細胞體內(nèi)重組。待培養(yǎng)72 h后挑取最小的一批單菌落擴菌驗證，根據(jù)待敲除基因lip以及donor DNA設(shè)計敲除驗證引物，分別以lip-/WT菌株與WT菌株的基因組為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖12所示，敲除基因沒有擴增出來，敲入基因擴增出來，大小為750 bp為陽性轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計得到轉(zhuǎn)化效率為9/32。根據(jù)待敲除基因adh5以及donor DNA設(shè)計敲除驗證引物，分別以adh5-/WT菌株與WT菌株的基因組為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖13所示，敲除基因沒有擴增出來，敲入基因擴增出來，大小為1 400 bp為陽性轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計得到轉(zhuǎn)化效率為10/32。

圖12 lip缺失基因PCR驗證Fig. 12 Identification of lip deletion by PCR

圖13 adh5缺失基因PCR驗證Fig. 13 Identification of adh5 deletion by PCR

3 討 論

酵母是一種單細胞真核生物，其清晰的遺傳背景、簡易的分子遺傳操作、可控的發(fā)酵過程及低廉的發(fā)酵生產(chǎn)成本，在外源蛋白表達生產(chǎn)及作為細胞工廠生產(chǎn)生物能源和化學(xué)品中發(fā)揮了極大的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的酵母基因編輯通常采用同源片段打靶抗性篩選的方法，往往因抗性標記在染色體上的整合而無法重復(fù)使用和無法去除，影響其在工業(yè)上的應(yīng)用。借助酵母的營養(yǎng)缺陷底盤細胞和Cre重組酶的酵母基因修飾改造系統(tǒng)[6]，雖然可以實現(xiàn)基因組的無痕改造，但需要兩次轉(zhuǎn)化，而且反向篩選假陽性多，造成操作繁瑣、周期長，也影響了酵母基因編輯的大規(guī)模實施。本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，只需構(gòu)建gRNA和Cas9表達質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)化S. cerevisiae細胞，造成靶位點特異性切割，大大提高了供體DNA的重組效率，無需抗性篩選標記的篩選，就可高效率進行基因組基因的刪除、插入及修飾。與鋅指核酸酶ZFN[15-16]和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酶TALEN[17]的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以有效地實現(xiàn)多個基因的編輯，在應(yīng)用中更低成本、更簡便、更高效[18-19]，是解決酵母基因編輯上述瓶頸問題的有效工具[32-34]。

酵母工業(yè)菌株都是雙倍體，對于雙倍體S. cerevisiae基因編輯的難度大于單倍體細胞。Church等[20]第一次利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)將單倍體S. cerevisiae中的can1基因敲除，效率為0.7%。Bao Zehua等[21]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)一次轉(zhuǎn)化單倍體S. cerevisiae后，通過液體長程培養(yǎng)6 d后再進行涂板篩選，可以同時敲除3 個基因。兩位研究者，基因編輯的均是單倍體S. cerevisiae細胞，采用上述方法必須將雙倍體酵母細胞分離為單倍體，基因修飾后再復(fù)性為雙倍體，操作繁瑣。本研究借鑒其研究，將CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)拓展應(yīng)用到雙倍體S. cerevisiae細胞的基因定向改造中，成功地將can1、pdc、adh3、adh2、adh1、pdh基因敲除，這種針對工業(yè)雙倍體菌株的基因編輯方法還鮮見報道。本研究還探索高效率連續(xù)敲除基因的方法流程，完全敲除3 個基因整個操作過程為17 d。利用2 個篩選標記的gRNA一次轉(zhuǎn)化同時刪除兩個lip和adh5基因也成功實現(xiàn)。本研究也探索了3 個基因同時敲除的方法，但由于2 個gRNA表達質(zhì)粒及Cas9表達質(zhì)粒采用4 種篩選標記篩選，而且3 種供體DNA同時轉(zhuǎn)化，影響轉(zhuǎn)化DNA的通量，轉(zhuǎn)化子較少，造成陽性突變株很少或沒有（數(shù)據(jù)略）。在以后研究中可改進為：采用不同基因的靶點gRNA構(gòu)建在同一個表達質(zhì)粒上，就可解決轉(zhuǎn)化子少的問題，實現(xiàn)多個基因的同時刪除及修飾。