史云鳳，張 彤，陳 沁*

（上海大學生命科學學院，上海 200444）

食品過敏是指人在攝入某種食物之后產(chǎn)生的一種不良反應，在醫(yī)學上屬于變態(tài)反應的一種，可以引起身體一些組織和器官甚至全身出現(xiàn)強烈反應[1-2]。食品過敏在全世界都有廣泛影響，大約包括5%兒童及3%～4%成年人，并呈上升趨勢[3]。WHO/FAO認證的8 大類過敏食物包括花生、魚、貝類、奶、蛋、大豆、堅果和小麥，它們引發(fā)了約90%食物過敏反應[4]。在這8 大類過敏原中花生過敏因其高度危險性、終身性和不可治愈性受到較大關注[5]。據(jù)調查，花生過敏在世界范圍內都相對普遍，美國有1.1%的人對花生過敏[6]，在法國花生過敏的人數(shù)約為0.3%～0.75%[7]，丹麥有0.2%～0.4%的人群對花生過敏[8]。目前在花生中已發(fā)現(xiàn)了17 種過敏蛋白[9]，其中Ara h 1和Ara h 2被認為是兩種最主要的過敏原，Ara h 1占花生蛋白總量的12%～16%[10]，為花生中含量最高的過敏原，與豌豆球蛋白具有高度同源性，易引發(fā)交叉反應[11]。Shin等[12]的研究發(fā)現(xiàn)Ara h 1蛋白含有23 個抗原表位，且熱穩(wěn)定性強，耐酶解，故能激活樹突狀抗原提呈細胞而導致機體發(fā)生過敏反應。

在進行Ara h 1過敏性研究時，從花生中提取的天然花生蛋白無疑最能體現(xiàn)其原本的致敏性，但是天然蛋白也有其不可避免的缺點[13]。首先在提取過程中，步驟繁多，會導致蛋白損失降解，活性下降；其次提取制備高純度蛋白難度較高，蛋白組分復雜對其致敏性的研究有較大影響。這些原因使得提取天然過敏原難以標準化、程序化、量產(chǎn)化。相較與提取天然過敏原，利用重組技術原核表達過敏原重組蛋白有產(chǎn)量高、易純化、質量穩(wěn)定等優(yōu)點，且具有與天然過敏原相似的免疫學特性，可以作為天然過敏原的代替物研究其過敏性[14]。

目前對過敏原蛋白致敏性的評價方法主要有生物信息學、血清學、模擬胃液消化、動物模型和細胞模型五種方法[15]。其中BALB/c小鼠是最常用的過敏動物模型。BALB/c小鼠是近交系小鼠，個體間差異較小，且BALB/c小鼠以Th2型細胞應答為主導，在受到過敏原刺激后更易產(chǎn)生高應答，所以廣泛應用于免疫學研究[16]。在對BALB/c小鼠致敏后，可以通過檢測小鼠組織的病理變化情況，特異性抗體、活性介質、細胞因子的含量，以及免疫細胞形態(tài)的變化綜合評價過敏原的致敏性。Moghaddam等[17]使用BALB/c小鼠建立花生過敏模型，嘗試了多種免疫流程致敏小鼠，結果表明烘烤后花生的致敏性提高。

大鼠嗜堿性白血?。╮at basophilic leukemia，RBL）細胞屬于肥大細胞系細胞，其表面有高親和力的IgE受體FcεRI，可以與IgE特異性結合處于敏化狀態(tài)，當過敏原再次被攝入時，與致敏細胞表面相鄰的兩個或兩個以上的IgE特異性結合，使得膜表面的FcεRI交聯(lián)活化，引發(fā)了肥大細胞的脫顆粒釋放組胺、β-己糖苷酶（hexosaminidase，β-HXA）等活性介質，在過敏反應中起關鍵作用[18,31]。因此在過敏反應的機制研究和檢測中有廣泛的應用。羅霞等[19]利用RBL-2H3細胞對幾種中藥注射液的潛在致敏性進行探究。Sun Na等[20]在比較了兩種RBL細胞系后，選用RBL-2H3建立了過敏原鑒定和臨床診斷的細胞模型。鑒于此，本實驗擬用BALB/c小鼠和RBL細胞模型研究重組Ara h 1蛋白的致敏性（圖1）。

圖1 本研究擬實驗思路圖Fig. 1 Graphic abstract of this study

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生品種為四粒紅，市售。

TRIzon 康為世紀生物科技有限公司；大腸桿菌E. coli DH5α、E. coli Rosetta（DE3）、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶HindIII、SalI、T4連接酶、PrimeScript?RT Master Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒、DNA Marker（DL5000） 寶生物工程（大連）有限公司；Ni親和層析樹脂 德國Qiagen公司；高保真酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase南京諾唯贊生物科技有限公司；HRP-羊抗兔IgG1、HRP-羊抗兔IgG2a、HRP-羊抗兔IgE 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；IL-4、IL-5、IFN-γ、組胺ELISA試劑盒 上海寶曼生物科技有限公司；氨基己糖（4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide，PNAG）美國Sigma公司；其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DNA水平電泳槽、蛋白垂直電泳槽、凝膠圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；EMax Plus單功能光吸收酶標儀 美國Molecular Devices公司；650E超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；4530R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；BX51光學顯微鏡日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 pET-28a-Ara h 1表達載體的構建

根據(jù)GenBank已報道的花生過敏原Ara h 1的基因序列設計擴增引物，在上游引物的5′端引入HindIII酶切位點和保護堿基CCC，在下游引物3′端引入S a l I酶切位點和保護堿基ACGC。上游引物：5′-CCCAAGCTTCGATGGCCGTCACCCCCAG CCTGCTG-3′；下游引物：5′-ACGCGTCGACTCA G C T G C A G G A A T T T T G G C A G G-3′。使用TRIzon法提取花生總RNA，將花生子葉在液氮中充分研磨后取30～50 mg放入RNase-Free離心管中，加入1 mL TRIzon混勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置2～3 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，去上清液，轉移到新的RNase-Free離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，放置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入1 mL的75%乙醇溶液洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心3 min，棄上清液，放置2～3 min晾干，加入50 μL無RNase水溶解，-80 ℃保存。

用PrimeScript? RT Master Mix試劑進行反轉錄反應，反應體系為5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA≤500 ng，加Rnase-Free ddH2O至10 μL。37 ℃孵育15 min，85 ℃、5 s使反轉錄酶失活。

用高保真酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），反應體系為Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，上下游引物（10 mmol/L）2×2 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 16 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸60 s共30 個循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，將目的條帶割膠回收，用HindIII和SalI雙酶切pEt-28a載體和回收條帶，用T4連接酶連接酶切后的目的基因和載體片段，構建重組表達質粒，轉入E. coli DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選陽性質粒。將陽性菌落擴大培養(yǎng)，提取質粒進行雙酶切鑒定，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序后用BLAST工具對結果進行序列對比分析。

1.3.2 Ara h 1蛋白的原核表達

比對成功的質粒轉入E. coli Rosetta（DE3）宿主表達菌中擴大培養(yǎng)，當菌液OD600nm約為0.5～0.6時加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為1 mmol/L誘導表達6 h。將表達完成的菌液3 000 r/min離心10 min收集細菌沉淀，將沉淀用超聲破菌緩沖液重懸后對細菌進行破碎，超聲破碎條件為功率300 W、超聲3 s停3 s，至菌液澄清透亮為止，該溶液中的蛋白即為全菌蛋白。將超聲破碎的菌液12 000 r/min離心15 min，上清液即為上清蛋白，沉淀為包涵體蛋白。將包涵體蛋白置于包涵體溶解液中4 ℃攪拌5～8 h至無沉淀，再將溶解好的溶液置于透析袋中，放入尿素濃度依次為6 mol/L-4 mol/L-2 mol/L-1 mol/L-0 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中透析，逐步將蛋白溶液中的尿素去除，完成包涵體蛋白的溶解復性。

1.3.3 重組Ara h 1蛋白的純化及鑒定

將溶解復性的包涵體蛋白與適量的鎳離子樹脂混合，4 ℃置于旋轉混合儀上旋轉混勻2 h。將充分混合作用的溶液加入純化柱中，先用含30 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗掉雜蛋白，再用含300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白（洗脫緩沖液體積約為鎳離子樹脂體積的3 倍，過多會稀釋目的蛋白的濃度），收集洗脫液，即為純化的重組蛋白。將重組蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠條送至基云（上海）生物科技有限公司進行質譜鑒定。

1.3.4 天然Ara h 1蛋白的純化

將花生粉碎后放入pH 7.4的Tris-HCl（1∶20（g/mL））中攪拌4 h，12 000 r/min離心30 min，取中間澄清溶液，裝入透析袋中20 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl中透析除NaCl。打開AKTA蛋白純化儀清洗裝置，設置清洗速率2.0 mL/min，洗至平線。裝柱，洗掉DEAESepharose Fast Flow柱中乙醇，15 min洗至平線，將A1管放入20 mmol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，平衡3～5 個柱體積。上樣用一次性注射器將50 mg蛋白粗提液經(jīng)裝置進入柱中，15 min后，用20 mmol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液洗至平線。洗脫時，將A2管放入1 mmol/L NaCl溶液中，設置每管洗脫體積4 mL，洗脫時間340 min。洗脫完成后收集0.2～0.3 mol NaCl所對應的蛋白。最后清洗柱子，將A2管放入水中，2 mL/min清洗60 min后，將A2管放入乙醇中，20 min后取下柱子。SDS-PAGE驗證每管收集的蛋白。

1.3.5 小鼠的致敏流程

將15 只BALB/c小鼠分為PBS對照組（5 只）、重組Ara h 1蛋白致敏組（10 只）、天然Ara h 1蛋白致敏組（10 只）。致敏方式為腹腔注射5 次，每次注射100 μL蛋白（0.1 μg/μL），每次間隔1 周。5 周后進行大劑量激發(fā)（腹腔注射5 倍劑量），30 min后將小鼠摘眼球取血處死，取出空腸組織和肺組織，血液4 ℃沉降過夜后吸出上層血清，-20 ℃保存。

1.3.6 小鼠空腸、肺病理切片的觀察

小鼠空腸組織和肺組織，剪成適當大小的體積，泡在體積分數(shù)10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅染色。光學顯微鏡下觀察組織的病理變化情況。

1.3.7 血液中特異性抗體與細胞因子含量的測定

將100 μL花生蛋白（0.1 mg/mL）加入96 孔板中，4 ℃包被過夜。ELISA洗液洗板（3 次，每次3 min，下同），加入200 μL 5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。ELISA洗液洗板后每孔加入200 μL稀釋1 000 倍的小鼠血清37 ℃孵育2 h。ELISA洗液洗板，每孔加入200 μL羊抗鼠HRP-IgE（1∶1 000）/羊抗鼠HRP-IgG1（1∶10 000）/羊抗鼠HRP-IgG2a（1∶1 000）37 ℃孵育2 h。ELISA洗液洗板后加入200 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色底物，37 ℃避光孵育15 min，最后加入50 μL終止液終止反應，測OD450nm值。

IL-4、IL-5、IFN-γ、組胺含量的檢測方法見上海寶曼生物科技有限公司ELISA試劑盒說明書。

1.3.8 RBL-2H3細胞模型對重組Ara h 1蛋白致敏性的評估

將處于對數(shù)生長期的RBL細胞（5×105個/mL）接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后PBS洗滌3 次，加入含有過敏血清的培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h后用Tyrode's緩沖液洗滌3 次，實驗組加入50 μL重組Ara h 1蛋白（10 ng/mL），全部釋放組加入50 μL 1% Triton-X100，空白組加入50 μL Tyrode's緩沖液，反應45 min后放入冰盒中終止反應。轉移30 μL上清液至另一96 孔板，每孔中加入5 mmol/L PNAG-檸檬酸溶液50 μL，37 ℃孵育1 h。1 h后每孔加入200 μL碳酸氫鈉緩沖液顯色，酶標儀測OD450nm。按下式計算實驗組β-HXA的釋放率：

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 重組Ara h 1蛋白的原核表達

2.1.1 pET-28a-Ara h 1表達載體的構建及測序

提取花生全RNA，電泳檢測其反轉錄PCR擴增產(chǎn)物，由圖2A可知，在2 000 bp左右有一條明亮條帶，大小與已公布的Ara h 1基因（1 845 bp）大小基本相符。將目的條帶與pET-28a載體雙酶切后連接，構建pET-28a-Ara h 1表達載體并進行雙酶切鑒定，由圖2B可見，5 000 bp左右處的條帶為pET-28a載體，2 000 bp處的條帶為Ara h 1基因。測序和BLAST工具分析顯示與已公布的Ara h 1基因序列相似度100%，表明Ara h 1基因已被成功克隆且已連接到pET-28a表達載體上。

圖2 Ara h 1基因的克?。ˋ）與pET-28a-Ara h 1載體（B）的雙酶切鑒定Fig. 2 Cloning of Ara h 1 gene (A) and identi fi cation of plasmid pET-28a-Ara h 1 (B)

2.1.2 重組Ara h 1蛋白的誘導表達與純化

將表達載體轉入Rosetta（DE3）宿主表達菌中，在16、30 ℃下誘導表達，提取全菌、上清液、包涵體蛋白，SDS-PAGE分析在不同溫度下重組蛋白的表達情況，結果如圖3A所示，在全菌中，30 ℃誘導有重組蛋白表達，16 ℃基本無表達；而在上清液中，30 ℃和16 ℃均無明顯表達；在包涵體中，30 ℃誘導蛋白表達量高于16 ℃誘導，故用30 ℃為誘導表達條件，且重組Ara h 1蛋白以包涵體形式表達，重組蛋白大小約為75 kDa，與預計相符。將包涵體蛋白溶解后透析復性，用鎳離子吸附柱純化帶有His標簽的重組蛋白，SDS-PAGE的結果（圖3B）表明純化后目的蛋白條帶單一，純度較高。進一步對重組蛋白樣品進行二級質譜分析（圖4），用MASCOT軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索比對，得分為14 994，經(jīng)鑒定重組蛋白為Ara h 1過敏原。

圖4 重組Ara h 1蛋白的鑒定Fig. 4 Identification of recombinant Ara h 1

2.2 重組Ara h 1蛋白的致敏性驗證

2.2.1 重組Ara h 1蛋白和天然Ara h 1致敏BALB/c小鼠的血清學分析

按1.3.5節(jié)致敏流程致敏小鼠，5 周后處死小鼠后取血清，測特異性抗體（IgE、IgG1、IgG2a）、細胞因子（IL-4、IL-5、IFN-γ）和組胺的含量。由圖5A、B可見，重組蛋白和天然蛋白致敏的小鼠血清中IgE、IgG含量均顯著高于PBS組小鼠，表明重組蛋白與天然蛋白一樣具有致敏性，且重組蛋白與天然蛋白相比有更高的致敏性。在兩組小鼠中IgG1滴度明顯高于IgG2a，故IgG1/IgG2a比值均大于1，表明在兩組小鼠體內過敏反應均為Th2型。細胞因子的測定結果（圖5C）顯示重組Ara h 1蛋白和天然Ara h 1致敏的小鼠血清中Th2型細胞因子IL-4和IL-5較PBS組有明顯升高，而Th1型細胞因子IFN-γ與對照組相比無明顯變化，進一步證實重組Ara h 1蛋白與天然蛋白類似，可以通過上調Th2型細胞因子，下調Th1型細胞因子引發(fā)小鼠Th2型過敏反應的發(fā)生。另外，重組Ara h 1蛋白和天然Ara h 1蛋白致敏的小鼠血清中組胺含量都明顯升高，也證明重組Ara h 1蛋白與天然Ara h 1蛋白一樣可以引發(fā)BALB/c小鼠過敏反應。

圖5 重組Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠的血清學分析Fig. 5 Serological analysis of BALB/c mice sensitized to recombinant Ara h 1

2.2.2 重組Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠的病理學分析

處死小鼠后，取空腸和肺組織，制成蘇木精-伊紅染色切片。空腸蘇木精-伊紅切片（圖6）顯示PBS組小鼠腸絨毛整齊清晰，沒有明顯損傷，腸壁平整光滑；而重組蛋白致敏小鼠的空腸出現(xiàn)了腸絨毛斷裂、腸壁破損增厚的現(xiàn)象，表明重組蛋白引起了BALB/c小鼠出現(xiàn)腸黏膜損傷和病變，提示重組Ara h 1花生蛋白可能存在一定的致敏性。

圖6 重組Ara h 1蛋白致敏小鼠的空腸病理切片F(xiàn)ig. 6 Pathological section of jejunum

由肺組織病理切片（圖7）可知，PBS組小鼠支氣管壁完整清晰，肺泡均勻完整，未見炎性細胞浸潤現(xiàn)象和充血現(xiàn)象；而在重組Ara h 1蛋白處理小鼠的肺切片中，肺支氣管、肺泡均發(fā)生不同程度的炎癥現(xiàn)象，包括小鼠肺支氣管和肺泡充血，肺支氣管破損和炎性細胞浸潤。表明重組Ara h 1蛋白可導致小鼠肺部發(fā)生炎癥病變，進一步說明重組Ara h 1蛋白具有一定的致敏性。

圖7 重組Ara h 1蛋白致敏小鼠的肺泡和肺支氣管病理切片F(xiàn)ig. 7 Pathological section of lung

2.2.3 RBL細胞模型對重組Ara h 1蛋白致敏性的評價

用重組Ara h 1蛋白刺激小鼠的血清致敏RBL細胞，檢測β-HXA釋放率，由圖8可見，重組Ara h 1蛋白組有更高β-HXA的釋放量，RBL細胞模型進一步確認重組Ara h 1蛋白具有致敏性。

圖8 重組蛋白對RBL-2H3細胞釋放β-HXA的影響Fig. 8 Release rate of β-HXA in RBL-2H3 cells stimulated by recombinant Ara h 1

3 討 論

花生過敏反應是典型的由IgE介導的I型超敏反應，對全身諸多臟器產(chǎn)生影響，可以引起面部以及喉部水腫，皮膚紅腫，血壓升高，甚至引發(fā)休克[21]。重組蛋白用于花生過敏原研究具有重要的意義[22]。重組表達系統(tǒng)主要有原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)和無細胞表達系統(tǒng)，其中大腸桿菌表達系統(tǒng)繁殖速度快、成本低、操作簡單、表達量高，是最常用的重組表達系統(tǒng)[23]。

但是大腸桿菌系統(tǒng)也有缺乏糖基化和磷酸化修飾、容易形成不溶的包涵體的缺點。pET-28a載體是最常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)載體，可以表達帶有His tag的融合蛋白，通過Ni離子親和純化可以簡便快速地得到目的蛋白[24]。據(jù)報道，Ara h 1為最重要的花生過敏原之一，本實驗擬探究Ara h 1蛋白對小鼠的致敏機制，故構建了pET-28a-Ara h 1表達載體，使用Rosetta大腸肝菌原核表達重組Ara h 1蛋白，由于重組蛋白以包涵體的形式表達，所以采用了高濃度的尿素將其溶解后梯度透析復性的方法得到可溶性蛋白，進行后續(xù)的研究。

動物模型中過敏反應發(fā)生的機制十分復雜，所以在判斷過敏原致敏性大小時需要綜合參考多個指標。劉志剛等在建立花生過敏模型時觀察了空腸的病理切片，發(fā)現(xiàn)過敏反應可以導致空腸損傷病變[25]。Zhang Wenju等[26]通過檢測不同處理的Ara h 2致敏小鼠后小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、組胺的含量來研究熱處理對花生蛋白Ara h 2致敏性影響。陳同強等[27]在建立龍蝦過敏小鼠模型時，主要通過ELISA測定小鼠血清中IgE、組胺以及被動皮膚過敏實驗檢測IgE抗體滴度評價龍蝦過敏。本研究結果顯示在重組Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠后，血清中特異性抗體（IgE、IgG）水平顯著升高，且IgG1/IgG2a大于1，呈Th2型過敏反應趨勢；Th1型細胞因子（IFN-γ）無變化、Th2型細胞因子（IL-4、IL-5）水平升高驗證并解釋了Th2型過敏反應發(fā)生的機理[28]；組胺釋放水平的顯著上升，進一步證實了重組Ara h 1蛋白的致敏性；觀察了小鼠的空腸和肺切片，有明顯病變發(fā)生，推測是由于組胺及其他炎性介質釋放導致。經(jīng)過與天然Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特異性抗體、細胞因子和組胺含量的對比，發(fā)現(xiàn)重組Ara h 1蛋白具有與天然Ara h 1蛋白相似的致敏性，均可以引發(fā)小鼠Th2型過敏反應的發(fā)生。

RBL細胞模型是最常見的致敏原細胞評價體系，這是由于RBL-2H3細胞系功能類似于體內的肥大細胞，體外模擬了過敏反應的發(fā)敏階段[29]。在致敏階段，IgE與肥大細胞表面FcεRI受體的胞外結構域結合，當相應抗原再次進入機體后，小片段的抗原決定簇將肥大細胞表面的兩個或兩個以上的IgE特異性結合，導致FcεRI的交聯(lián)，引發(fā)了肥大細胞的脫顆粒，這是過敏反應中最重要的環(huán)節(jié)。由于在RBL細胞中組胺表達量較少，且組胺半衰期較短，故通過檢測β-HXA含量判斷RBL脫顆粒水平[30-31]。本實驗中，重組Ara h 1蛋白具有更強的使RBL細胞脫顆粒的能力，這與小鼠實驗中重組蛋白致敏的小鼠血清中有大量組胺釋放的結果相互印證，更進一步證明了重組Ara h 1蛋白存在致敏性。

綜上所述，本實驗成功重組表達了花生蛋白Ara h 1，且經(jīng)過驗證重組Ara h 1蛋白具有一定的致敏性，且與天然Ara h 1蛋白相似。