花朋朋，熊 煜，于志穎，劉 斌，，趙立娜

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002）

小球藻（Chlorella pacifica）是一種單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門 （Chlorophyra）、綠藻綱 （Chlorophyceae）、小球藻屬（Chlorella），具有生長繁殖迅速等特點(diǎn)。小球藻富蛋白質(zhì)[1]，營養(yǎng)價(jià)值高，易于被人體吸收，包含8種人體必需氨基酸，完全能滿足人、動(dòng)物的生長所需，具有很高的應(yīng)用價(jià)值[2-4]。目前，國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)是藻類蛋白活性肽，大部分研究主要集中在開發(fā)藻類多肽的抗氧化、抗菌、降壓、降脂、預(yù)防骨質(zhì)疏松等生物活性免疫調(diào)節(jié)等功能性生物活性肽[5]，然而對(duì)小球藻鈣螯合肽活性的研究卻不常見。

鈣在人體機(jī)能中扮演著重要功能作用，當(dāng)機(jī)體攝入鈣不足會(huì)造成佝僂病、軟骨病、骨質(zhì)疏松等各種疾病，同時(shí)會(huì)對(duì)人類的生命健康造成重大的危害[6。目前市場上鈣補(bǔ)充制劑很多，主要有無機(jī)鈣、有機(jī)鈣[7]。然而，眾多補(bǔ)鈣產(chǎn)品的生產(chǎn)及銷售并未能從根本上改變?nèi)藗兊娜扁}問題，其原因在于一方面人體對(duì)鈣的攝入不夠，另外一方面就是人體機(jī)能內(nèi)部對(duì)鈣的有效吸收率低[8]，隨之而來又有一個(gè)弊端，雖然一些有機(jī)鈣制劑能夠可以大量被機(jī)體吸收，但會(huì)伴隨負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)失調(diào)，反而抑制鈣的吸收。目前，已發(fā)現(xiàn)多肽具有礦質(zhì)載體的作用，可與金屬離子螯合形成多肽-鈣復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)小腸對(duì)鈣的吸收，如牛乳酪蛋白磷酸肽[9]、蛋黃肽、大豆蛋白肽、魚鱗及魚骨肽[10-18]。但這些多肽制備價(jià)格昂貴，因此小球藻多肽螯合鈣以其生物效價(jià)高、易吸收、無毒、無刺激作用等優(yōu)點(diǎn)[19]成為了為第4代補(bǔ)鈣制劑，得到了人們的青睞。

試驗(yàn)以小球藻為原料，通過中性蛋白酶酶解法，來制備小球藻多肽，并將其與Ca2+進(jìn)行螯合，目的在研發(fā)具有螯合率較高的小球藻多肽-鈣螯合物。利用單因素試驗(yàn)探究了螯合時(shí)間、螯合溫度、螯合肽鈣質(zhì)量比、螯合底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值對(duì)螯合率的影響。并通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，制得了較高品質(zhì)的小球藻多肽-鈣螯合物。該研究可充分發(fā)揮多肽和礦物質(zhì)元素對(duì)人體的雙重營養(yǎng)功能特性，為小球藻應(yīng)用開發(fā)提供了一種新的開拓思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻，臺(tái)灣綠藻工業(yè)股份有限公司提供；中性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供；EDTA、氫氧化鉀（KOH）、三乙醇胺、鈣指示劑、CaCl2、鈣羧酸指示劑、無水乙醇和氫氧化鈉（NaOH）等，均為分析純；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-A型低速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FE20型精密pH計(jì)、ZD-2型雷磁電位自動(dòng)滴定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；FD-3型冷凍干燥機(jī)，河北國輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；電子分析天平，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司產(chǎn)品；SHA.B型精達(dá)水浴恒溫振蕩器，常州精達(dá)儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小球藻多肽的制備流程[20]

小球藻→去離子水溶解（料液比1∶30）→添加NaOH（溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%）→在50℃下水浴1 h→6層紗布過濾→離心（5 000 r/min，10 min） →取上清液→調(diào)pH值3（30 min） →離心（5 000 r/min，10 min）→沉淀冷凍干燥→小球藻蛋白→去離子水溶解（料液比1∶30）→調(diào)整pH值7.5→中性蛋白酶酶解（40℃）→40℃水浴6 h→沸水浴滅酶（10 min）→離心（4 500 r/min，10 min） →上清液（小球藻多肽溶液）→冷凍干燥→小球藻多肽。

1.3.2 小球藻多肽-鈣螯合物的制備

稱取一定量小球藻多肽復(fù)溶成一定濃度的多肽溶液，加入1 mol/L NaOH調(diào)整pH值為9.0，按一定質(zhì)量比加入鈣離子（以無水氯化鈣的形式），將其放置于一定溫度的水浴搖床中充分反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)后置于室溫冷卻，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min取上清液，加入5倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min取沉淀，用無水乙醇對(duì)沉淀物洗滌數(shù)次，將其置于烘箱中進(jìn)行低溫干燥處理，使無水乙醇揮發(fā)，然后進(jìn)行凍干獲得多肽-鈣螯合物粉末。

1.3.3 測(cè)定總鈣含量的測(cè)定[21]

反應(yīng)液與去離子水以0.1∶50（mL∶mL），依此將2~3 mL三乙醇胺、0.8~1.0 mL氫氧化鉀溶液、適量鈣指示劑加入，搖勻，接著用EDTA溶液滴定，溶液從紫紅色變成純藍(lán)色為終點(diǎn)，記錄EDTA體積V0。根據(jù)公式計(jì)算可得總鈣含量M0。

1.3.4 螯合鈣含量的測(cè)定

反應(yīng)液與去離子水以0.1∶50（mL∶mL），量筒量入20 mL的乙醇，恒溫條件下振搖1 h，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，去除上清液，蒸餾水定容20 mL，吸取2 mL此溶液，同1.3.3步驟（EDTA滴定），記錄EDTA體積V1。根據(jù)公式計(jì)算可得螯合鈣含量 M1。

1.3.5 鈣螯合率的測(cè)定

式中：M0——反應(yīng)液中總鈣含量，g；

M1——表示同體積反應(yīng)液中螯合鈣的鈣含量，g。

1.3.6 螯合條件單因素試驗(yàn)

（1）螯合時(shí)間對(duì)鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比1∶2水浴搖床溫度設(shè)置40℃，螯合時(shí)間分別為 20，30，40，50，60，70，80 min，測(cè) 3 次螯合率。

（2）螯合溫度對(duì)鈣螯合率的影響。取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比1∶2，水浴搖床溫度分別設(shè)置30，40，50，60，70，80℃，螯合時(shí)間50 min，測(cè)3次螯合率.

（3）肽鈣質(zhì)量比對(duì)鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比分別為 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，水浴搖床溫度設(shè)置50℃，螯合時(shí)間50 min，測(cè)3次螯合率。

（4）底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，3%，4%，5%，6%，7%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比3∶1，水浴搖床溫度設(shè)置50℃，螯合時(shí)間50 min，測(cè)3次螯合率。

（5）pH值對(duì)鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，調(diào)整pH值分別為5，6，7，8，9，10，11，12，肽鈣質(zhì)量比3∶1，水浴搖床溫度設(shè)置50℃，螯合時(shí)間50 min，測(cè)3次螯合率。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以鈣螯合率為指標(biāo)，選取4個(gè)對(duì)鈣螯合率影響最顯著的因素（螯合溫度、肽鈣質(zhì)量比、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值），采用Box-Behnken組合方法進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)運(yùn)用Design Expert 8.1軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 螯合時(shí)間對(duì)鈣螯合率的影響

螯合時(shí)間對(duì)鈣螯合率的影響見圖1。

圖1 螯合時(shí)間對(duì)鈣螯合率的影響

由圖1可知，鈣螯合時(shí)間在20~50 min時(shí)，鈣螯合率隨螯合時(shí)間的延長而升高；當(dāng)螯合時(shí)間在50 min時(shí)，鈣螯合率最高，達(dá)到79%±0.02%；但是，當(dāng)螯合時(shí)間大于50 min時(shí)，鈣螯合率開始下降。此現(xiàn)象說明螯合時(shí)間過長，很容易造成鈣螯合物結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，反而不利于鈣螯合物的發(fā)生[22-23]。此結(jié)果表明螯合時(shí)間對(duì)鈣螯合率沒有顯著性差異，說明鈣螯合反應(yīng)迅速，螯合時(shí)間對(duì)螯合率的影響較小[24]。所以在后續(xù)的螯合試驗(yàn)中，選擇螯合時(shí)間為50 min。

2.1.2 螯合溫度對(duì)鈣螯合率的影響

螯合溫度對(duì)鈣螯合率的影響見圖2。

圖2 螯合溫度對(duì)鈣螯合率的影響

由圖2可知，鈣螯合溫度在30~60℃時(shí)，鈣螯合率快速增加；在60℃時(shí)，鈣螯合率最高，達(dá)到85%±0.01%；當(dāng)螯合溫度大于60℃時(shí)，鈣螯合率開始下降，原因在于一方面溫度過高會(huì)使氨基酸或者小肽發(fā)生羰氨反應(yīng)，與鈣離子形成競爭，導(dǎo)致鈣螯合率降低，另一方面溫度過低會(huì)使螯合反應(yīng)速率變慢[25-27]。因此螯合溫度定位60℃，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 肽鈣質(zhì)量比對(duì)鈣螯合率的影響

多肽與氯化鈣質(zhì)量比對(duì)鈣螯合率的影響見圖3。

圖3 多肽與氯化鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響

由圖3所示，當(dāng)小球藻多肽與鈣質(zhì)量比為3∶1時(shí)，鈣螯合率最大為87%±0.02%，繼續(xù)增大氯化鈣質(zhì)量，鈣螯合率開始下降；當(dāng)氯化鈣的添加量較小，多肽過量時(shí)，使得部分多肽無法與鈣離子形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，造成了活性多肽的浪費(fèi)，當(dāng)Ca2+含量過高時(shí)，多肽中的鈣螯合位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài)，導(dǎo)致大多數(shù)鈣以游離態(tài)的形式出現(xiàn)在反應(yīng)體系中，最終導(dǎo)致鈣螯合率的較低[28]。最終選擇肽鈣質(zhì)量比為3∶1，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面的優(yōu)化。

2.1.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鈣螯合率的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鈣螯合率的影響見圖4。

圖4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鈣螯合率的影響

由圖4可知，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，鈣螯合率最大為90%±0.01%，再增加多肽質(zhì)量濃度鈣螯合率反而下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)多肽濃度較大時(shí)，會(huì)造成反應(yīng)體系的黏度系數(shù)，減小了二者的接觸面積和幾率，不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行，降低了鈣螯合率。最終，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.5 pH值對(duì)鈣螯合率的影響

pH值對(duì)鈣螯合率的影響見圖5。

圖5 pH值對(duì)鈣螯合率的影響

由圖5可知，當(dāng)螯合液在酸性條件下時(shí)，鈣螯合率較低。這可能是由于H+與Ca2+二者發(fā)生對(duì)供電子基團(tuán)的競爭[29]，對(duì)小球藻多肽-鈣螯合物的生成造成了阻礙。當(dāng)螯合液pH值在5.0~9.0時(shí)，隨著pH值的不斷升高，鈣螯合能力快速升高，在pH值9.0時(shí)，鈣螯合率最大為96%±0.01%；但pH值超過9.0時(shí)，鈣含量反而下降，此時(shí)可能因?yàn)樵趶?qiáng)堿條件下容易發(fā)生了一系列的副反應(yīng)，導(dǎo)致鈣螯合率較低[30]。因此選擇pH值為9.0，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 螯合條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

如表1所示，以鈣螯合率作為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert回歸分析軟件分析表1中29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值，綜合數(shù)據(jù)分析，各試驗(yàn)單因素對(duì)鈣螯合率的影響，得出如下回歸方程：

響應(yīng)面二次模型方差分析見表2。

表2 響應(yīng)面二次模型方差分析

其回歸方程達(dá)到了極顯著水平（p<0.01），且失擬項(xiàng)不顯著（p>0.05），表明此建模成功?？倹Q定系數(shù)R2=0.945 3，表明該方程是高度顯著的，即該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)值擬合較好。由表2可知，D，AD，CD，BC，B2，C2，D2項(xiàng)都對(duì)鈣螯合率有顯著的影響，順序?yàn)閜H值>肽鈣質(zhì)量比>底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)>螯合溫度。從響應(yīng)面分析圖可以直觀地看到2個(gè)因素間的交互作用對(duì)鈣螯合率的影響大小，螯合溫度、肽鈣質(zhì)量比、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值4個(gè)因素之間交互作用對(duì)鈣螯合率的影響。

如表2和圖6所示，對(duì)鈣螯合率影響最顯著的交互作用是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值，其次是螯合溫度和pH值，而肽鈣質(zhì)量比和pH值之間的交互作用，對(duì)響應(yīng)值沒有顯著差異。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及對(duì)小球藻多肽鈣-螯合物制備的優(yōu)化

通過Design Expert軟件綜合分析得出的回歸方程，讓各因素保持不變，只對(duì)回歸模型進(jìn)行適宜的緯度調(diào)整，從而考查各因素間的交互作用對(duì)小球藻多肽-鈣螯合物鈣螯合率的影響。通過對(duì)回歸分析結(jié)果進(jìn)行分析，作出響應(yīng)面和等高線圖。

如圖6所示，等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明二者交互作用顯著，同時(shí)相應(yīng)面圖出現(xiàn)最高點(diǎn)，鈣螯合率值最大[31]。試驗(yàn)表明，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值之間、pH值和螯合時(shí)間之間存在著較顯著的交互作用。

交互作用對(duì)鈣螯合率影響的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 交互作用對(duì)鈣螯合率影響的響應(yīng)面圖

利用Design Expert軟件由所建的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出小球藻多肽-鈣螯合物的鈣螯合率最高參數(shù)條件為螯合溫度54.05℃，肽鈣質(zhì)量比3.13，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.75%，pH值9.02，螯合時(shí)間50 min，鈣含量的預(yù)測(cè)值為96.14%，為適合操作，調(diào)整條件螯合溫度75℃，pH值9，肽鈣質(zhì)量比2∶1，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，螯合時(shí)間60 min，做3組平行試驗(yàn)。對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得結(jié)果表明在此條件下螯合率為97.15%±0.001 225%，與預(yù)測(cè)值無顯著性差異（p>0.05）。證明此條件為小球藻多肽鈣螯合反應(yīng)的最優(yōu)條件，該回歸方程可應(yīng)用于實(shí)踐。

3 結(jié)論

由響應(yīng)面分析法優(yōu)化小球藻多肽與鈣螯合的最佳工藝條件為螯合溫度50℃，pH值9，肽鈣質(zhì)量比3∶1，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，螯合時(shí)間60 min，在此條件下制備的螯合物的鈣螯合率為97.15%±0.001 225%，與預(yù)測(cè)值96.14%沒有顯著性差異。小球藻多肽和鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)，生成了一種新型多肽-鈣螯合物，為合成新型補(bǔ)鈣制劑的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為小球藻的開發(fā)利用提供了一個(gè)新的研究思路。