方獻平，查倩，奚曉軍，和雅妮，蔣愛麗*

（上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所，上海 201403）

葡萄灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的一種極具威脅性的真菌性病害。病菌分生孢子?；液谏蕵錉罘种?，在相對濕度75%～100%時快速生長[1]?；移咸焰呔?～31 ℃下均能對新梢、葉片、果梗、花序和果實產(chǎn)生危害。葡萄染病后，新梢和葉片會出現(xiàn)褐色病斑或灰色霉層，花序萎縮，幼果脫落，成果有凹陷病斑[2]。

近年來，隨著葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，葡萄灰霉病防控越來越引起生產(chǎn)者的重視。一方面可通過田間管理降低其危害，另一方面選用抗性品種降低發(fā)病風險。然而灰霉病抗性品種材料篩選周期較長、成本高；植物病害的離體抗性鑒定技術由于不受場地限制，具有省工、省時、方便快速和準確性高等優(yōu)點，已經(jīng)在黃瓜[3]、辣椒[4]和蘋果[5]等作物上廣泛應用。在灰霉病抗性鑒定研究方面，任志華等也做了積極有益的探索，在預先設定好的22 ℃和90%的相對濕度下直接進行病菌接種，取得了比較好的鑒定結(jié)果[6]。本研究擬在前人研究的基礎上，通過設置不同的接種溫度、濕度和時長，探索灰葡萄孢菌侵染葡萄葉片的最佳發(fā)生條件，建立葡萄灰霉病抗性快速鑒定方法，并在現(xiàn)有葡萄品種（系）上進行應用，以縮短抗性材料的篩選年限，加快育種進程。

1 材料及方法

1.1 材料

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）由本課題組分離純化，并經(jīng)過形態(tài)學觀察和分子鑒定。對灰葡萄孢菌接種溫度、濕度和時長等發(fā)病條件開展研究試驗的3個葡萄品種為：‘巨峰’‘夏黑’‘金手指’。進行應用試驗的另外再加‘醉金香’‘信濃樂’‘陽光玫瑰’‘申愛’‘申豐’‘申華’‘申玉’‘滬培1號’‘滬培3號’9個品種；以及6個品系‘滬20’‘滬21’‘滬22’‘滬24’‘滬27’‘滬28’。

1.2 方法

選用在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周的菌落，使用打孔器進行打孔，將打孔后的菌餅鋪在葡萄葉片背面，并放入人工培養(yǎng)箱（上海皓莊，型號LI280A）中培養(yǎng)，設置不同的溫度（15 ℃、20 ℃和22 ℃）、相對濕度（80%、90%和95%）和時長（2 d和3 d）組合觀察記錄葉片感染情況，并用智能葉面積測量系統(tǒng)（托普云農(nóng)，型號YMJCH）測算病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后溫度對葡萄葉片灰霉病抗性的影響

為了摸索灰葡萄孢菌的最佳侵染溫度，預先統(tǒng)一設定90%的固定相對濕度培養(yǎng)條件，并在2 d后觀察病癥表現(xiàn)。在選定的3個品種中，‘巨峰’呈現(xiàn)出不同溫度培養(yǎng)條件下的顯著感病差異，在20 ℃時發(fā)病最為明顯，病斑面積達到了855.30 mm2?！暮凇汀鹗种浮?0 ℃時發(fā)病程度比在22 ℃稍高，20 ℃時病斑面積分別達到了326.85 mm2和186.27 mm2。3個品種在15 ℃下，接種2 d后都未見到感病癥狀，病斑面積都為0（圖1）。由此可見，20 ℃可以作為葡萄葉片抗性鑒定過程中灰葡萄孢菌的最佳接種侵染溫度。

2.2 接種后相對濕度對葡萄葉片灰霉病抗性的影響

在已經(jīng)明確20 ℃為最佳侵染溫度的基礎上，設置了80%、90%和95%相對濕度培養(yǎng)條件，并在2 d后觀察病癥。在選定的3個品種中，‘巨峰’和‘夏黑’都呈現(xiàn)出在90%和95%相對濕度培養(yǎng)條件下更易發(fā)病的現(xiàn)象，‘金手指’則在相對濕度80%時發(fā)病程度稍重于95%時發(fā)病程度，病斑面積分別為167.42 mm2和75.43 mm2，推測可能與品種差異有關。但‘巨峰’‘夏黑’和‘金手指’3個葡萄品種葉片都在相對濕度為90%時發(fā)病程度達到最大值，而更高的相對濕度并未進一步加快發(fā)病進程（圖2）。由此可見，灰葡萄孢菌接種葡萄葉片過程中的最佳相對濕度為90%。

圖1 在不同溫度條件下灰葡萄孢菌侵染3個不同葡萄品種葉片的病斑面積比較Figure 1 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different temperatures

圖2 在不同濕度條件下灰葡萄孢菌侵染3個不同葡萄品種葉片的病斑面積比較Figure 2 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different humidity

2.3 接種時長對葡萄葉片灰霉病抗性的影響

在明確最佳接種溫度20 ℃和相對濕度90%的灰葡萄孢菌侵染后，進一步探索了能較明顯區(qū)分發(fā)病差異程度的最佳病菌接種時長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管侵染時間從2 d延長到3 d，能進一步加劇感染病斑的擴大，但同時不同品種對病菌的抗性區(qū)分度在變小，差異系數(shù)從0.899降到了0.225（圖3）。由此可見，灰葡萄孢菌接種2 d后的病情指標，可以較好地區(qū)分不同葡萄品種對灰霉病的抗性差異。

2.4 快速抗性鑒定方法在葡萄品種（系）上的應用

應用建立好的離體葉片快速抗性鑒定方法，在20 ℃和相對濕度90%條件下接菌2 d，18個葡萄品種（系）葉片的抗性研究結(jié)果顯示：以‘巨峰’為對照，葡萄品系‘滬22’對灰霉病菌的受感染程度最小，感病面積只有3.8 mm2，顯示出高抗性；其余品種（系）抗性從高到低依次為‘申豐’‘滬培1號’‘金手指’‘夏黑’‘申玉’‘滬20’‘申華’‘信濃樂’‘滬24’‘滬28’‘陽光玫瑰’‘申愛’‘巨峰’‘滬培3號’和‘醉金香’，而‘滬21’和‘滬27’兩個品系顯示對灰霉菌高感癥狀，感染病斑面積分別達到了1158.12 mm2和1256.64 mm2（圖4）。

3 討論與結(jié)論

低溫、高濕一般是灰霉病流行的主要影響因素，然而并非所有的低溫都符合最佳發(fā)病生長條件。本研究通過系統(tǒng)比較不同溫度、濕度和接種時間長短，進一步發(fā)現(xiàn)20 ℃比15 ℃和22 ℃更加適合灰葡萄孢菌的繁殖；90%的最佳相對濕度則進一步佐證了任志華等研究中試驗條件設置的科學性[6]，而95%的相對濕度未進一步有效促進病菌的侵染進程。這一發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)上提供了重要指導意義，因此葡萄灰霉病的防治可以通過控制溫濕度來進一步抑制病害的發(fā)生。

圖3 在不同接種時長下灰葡萄孢菌侵染3個不同葡萄品種葉片的病斑面積比較Figure 3 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different time points

灰葡萄孢菌能侵染葡萄各個生長階段，而抗病性鑒定是葡萄育種過程中非常關鍵的一環(huán)；通過抗性材料的篩選可以進一步明確育種方向，加快育種進程。葡萄抗病性鑒定可以分為田間鑒定和室內(nèi)鑒定，其中田間鑒定操作相對繁瑣，必須考慮到當時的氣候條件，有些自然情況下存在不發(fā)病的情況。如果在田間用人工接種的方法，則必須充分制造發(fā)病的條件，并且經(jīng)常需要選擇適合發(fā)病的生長地塊。而室內(nèi)鑒定從實施步驟上來說則相對簡單，操作可控性更強。可以借助人工氣候室或者培養(yǎng)箱，調(diào)控合適的溫度和濕度，創(chuàng)造有利于植株發(fā)病的氣候條件，沒有氣候的限制。對于想通過快速鑒定手段來達到抗性材料篩選的目的，室內(nèi)鑒定可以更好的實現(xiàn)這一目標。室內(nèi)鑒定法已經(jīng)應用于葡萄抗白粉病[7-8]、霜霉病[9]和黑痘病[10-11]等相關抗性資源鑒定的工作中。在灰霉病種質(zhì)資源抗性鑒定方面，Gabler等[12]通過研究不同葡萄品種果實對灰霉菌的抗性特點，確定圓葉葡萄和美洲種具有較好的抗性。段慧[13]也通過研究初步確定了刺葡萄1、4號高抗灰霉病，而刺葡萄2、3號高感灰霉病。本研究首先以有抗性差異的3個葡萄品種葉片材料，對灰葡萄孢菌接種溫度、濕度和時間長度等發(fā)病條件進行研究，形成了葡萄灰霉病抗性離體葉片快速鑒定方法，并應用該法對‘巨峰’‘夏黑’‘金手指’‘醉金香’‘陽光玫瑰’和申滬系列等在內(nèi)的18個葡萄品種和雜交株系的灰霉病抗性進行了鑒定和比較。結(jié)果表明，溫度20 ℃、濕度90%是灰葡萄孢菌的最佳侵染條件，在此條件下接種2 d后的病情指標可以較好地區(qū)分18個葡萄品種（系）對灰霉病的抗性差異，其中葡萄新品系‘滬22’對灰葡萄孢菌顯示高抗，而‘滬21’和‘滬27’兩個品系高感灰霉病。

圖4 灰葡萄孢菌對18個不同葡萄品種（系）葉片的侵染病斑面積比較Figure 4 Comparison of lesion area of eighteen different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea