胡光云 宋 陽 孫 哲 甄玉花 全小明 王一飛

(1 陸軍軍醫(yī)大學護理系，重慶市 400038，電子郵箱：2234381336@qq.com：2 廣州中醫(yī)藥大學護理學院，廣東省廣州市 510405；廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院3 腫瘤科，4 護理部，廣東省廣州市 510405)

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤之一，主要由平滑肌細胞增殖引起[1]，常見于30～50歲婦女，患病率呈逐年上升趨勢。研究表明，子宮肌瘤是未絕經(jīng)婦女行全子宮切除的最主要原因[2]。但該病發(fā)病機制雜，目前尚未完全明確[3]，需要進行體外細胞及動物實驗等研究進一步探討[4]。體外細胞模型的建立是研究本病發(fā)生機制及防治措施的有效手段，但原代細胞培養(yǎng)存在貼壁率低、復蘇存活率低等特點。本研究旨在不影響培養(yǎng)效果的前提下，改良原代細胞培養(yǎng)技術，為子宮肌瘤的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源 本研究所用病理組織取自在廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院行全子宮切除術或行子宮肌瘤剔除術的15例子宮肌瘤患者?；颊吣挲g35～50(43.0±5.0)歲，術前至少3個月沒有接受激素治療，術后病理學診斷為子宮肌瘤。

1.2 實驗試劑及設備 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自Gibco公司(批號：25200-056)，胎牛血清購自Gibco公司(批號：10270-106)，青霉素/鏈霉素購自南京凱基生物公司生產(chǎn)(批號：15140-122)，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)購自南京凱基生物公司(批號：25200-056)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)購自HyClone公司(批號：SH30256.01)，Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司(批號：C0130)，平滑肌肌動蛋白抗體購自Abcam公司(批號：ab134813)。CO2細胞培養(yǎng)箱(NAPCO公司，型號：Series 5400)，細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，LX70倒置顯微鏡(Olympus公司，型號：CX41)，全自動拍照裝置(Lumenera公司INFINITYLite系列，型號：PMZO-35)，水浴箱：(德國Memert公司)，低速離心機(ANKE公司，型號：TDL-5c)，超低溫冰箱(SANYO公司，型號：MDF-U53V)。

1.3 實驗方法

1.3.1 人子宮肌瘤組織的保存：在無菌操作下取數(shù)塊子宮肌瘤瘤核組織塊，大小約為1 cm3，將組織塊分為常規(guī)組及改良組。將常規(guī)組標本置于4℃ PBS中(內含青霉素/鏈霉素1 000 IU /ml)，改良組標本放入Hank液(Gibco公司，批號：8118275)(內含青霉素/鏈霉素1 000 IU/ml)中，低溫(0～4℃)條件下迅速送至實驗室進行細胞培養(yǎng)。

1.3.2 原代細胞的獲取與細胞培養(yǎng)：(1)常規(guī)組采用膠原酶消化法獲得人子宮肌瘤原代細胞：參照韓虹娟等[5]改進的人子宮肌瘤細胞培養(yǎng)方法獲取原代細胞，首先將子宮肌瘤組織塊放入含PBS(含3%青霉素/鏈霉素)的無菌培養(yǎng)皿中進行梯度漂洗3次，除去血跡及組織外層；然后將漂洗好的組織塊移入無血清DMEM培養(yǎng)基，用彎鑷和眼科剪將組織塊修剪成約1 mm3大??；最后用無菌吸管將修剪后的組織小塊及DMEM液移至50 ml的離心管中，待組織沉淀后棄上清，并向管中加入0.2%的Ⅰ型膠原酶10 ml，37℃水浴消化1.5～2 h(每30 min搖晃1次)，組織塊明顯變小且消化液變渾濁后，加入足量的完全培養(yǎng)基終止消化；1 000 r/min離心10 min棄上清，再用200目的細胞篩過濾收集濾液，將細胞接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中，加入20%的完全培養(yǎng)基(DMEM+20%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后待細胞貼壁進行第1次換液，以后每48 h換液1次，待細胞融合達70%～80%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。(2)改良組采用改良的膠原酶消化法獲得原代細胞：漂洗、修剪組織過程同常規(guī)組，將約1 mm3大小的組織塊移至50 ml的離心管，待組織沉淀后棄上清，加入0.2%的Ⅰ型膠原酶(膠原酶與組織塊體積比例為2 ∶1)消化，混合均勻后，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。消化2 h后，搖晃離心管，再消化5～6 h，組織塊明顯變小且消化液變渾濁后，用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集濾液，濾液加入完全培養(yǎng)基終止消化，培養(yǎng)基與膠原酶體積比為2 ∶1；濾網(wǎng)上的組織塊再次放入50 ml離心管中，加入膠原酶(組織塊與膠原酶體積比為1 ∶1)再次消化，再次消化1 h后過濾組織懸液，收集細胞懸液，終止消化。將兩次終止消化后的細胞懸液，以1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)吹打均勻，再次1 000 r/min離心5 mim，棄上清，將細胞接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中，加入10%的完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每48 h換液1次，待細胞融合達70%～80%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.3.3 細胞的凍存：從傳帶后第2代開始，待細胞融合80%時準備凍存，凍存前一晚換液，按細胞傳代方法獲取細胞懸液，離心過程中按PBS ∶胎牛血清 ∶二甲基亞砜為6 ∶3 ∶1 配置凍存液，放入4℃的冰箱中待用。細胞離心結束，倒掉上層清液，將預冷好的凍存液緩慢加入離心管中，吹打均勻后放入凍存管，靜止幾分鐘，寫明凍存細胞種類，凍存日期，放入程序降溫盒，凍存24 h后，移至-80℃的冰箱。

1.3.4 子宮肌瘤細胞的復蘇：迅速從-80℃冰箱中取出凍存管，直接浸入37℃恒溫水浴箱中，并不時搖動使其盡快融化。注意不可使水浸沒瓶蓋，以避免污染。然后從37℃水浴箱中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，放入離心管并滴加10倍以上含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min離心5 min ，棄上清，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 觀察指標

1.4.1 細胞形態(tài)觀察及細胞鑒定：細胞貼壁后，在倒置顯微鏡下直接觀察細胞的形態(tài)及生長情況，并應用全自動拍照系統(tǒng)記錄細胞的形態(tài)變化；培養(yǎng)至第3代，采用α-平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學法鑒定細胞，評估細胞首次傳代成功的時間。傳代周期為5～7 d，傳至第3～5代時細胞形態(tài)均勻，生長良好，質量穩(wěn)定，經(jīng)鑒定后用于實驗[5]。

1.4.2 獲得細胞數(shù)及細胞貼壁率：(1)兩組均于終止消化后，收集細胞懸液進行細胞計數(shù)。(2)將原代細胞分別以(5～10)×107個/L接種于含有10% 完全培養(yǎng)基的25 mm3培養(yǎng)皿中，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，吸取上清液，計算細胞貼壁率：細胞貼壁率=(接種細胞數(shù)-上清細胞數(shù))/接種細胞數(shù)×100%。實驗重復3次，取3次的平均值為細胞貼壁率。

1.4.3 細胞傳代次數(shù)及復蘇情況：(1)如在顯微鏡下觀察到細胞形態(tài)均勻、生長良好、質量穩(wěn)定，則評定為生長良好的細胞，當出現(xiàn)細胞體積增大、細胞核凹陷、核膜崩解等細胞結構的變化時，說明細胞已出現(xiàn)衰老[6]，不宜再進行傳代培養(yǎng)，記錄兩組細胞可傳代培養(yǎng)的次數(shù)。(2)取凍存后的細胞進行復蘇培養(yǎng)，24 h后如鏡下觀察到細胞融合50%～60%，則說明復蘇成功。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 人子宮肌瘤原代細胞形態(tài)及細胞鑒定 倒置顯微鏡下可見兩組細胞均呈長梭形，放射狀生長，成束的細胞平行排列，部分區(qū)域細胞多層重疊，部分呈單層，高低起伏呈現(xiàn)平滑肌細胞特征性的“峰-谷”狀生長[5]，見圖1～2。免疫組化鑒定結果顯示α-平滑肌肌動蛋白抗體呈陽性反應，光鏡下細胞輪廓清楚，中央有卵圓形的核，核仁及胞質清晰， 核旁可見空泡， 胞漿飽滿，見圖3～4。

圖1 改良組子宮肌瘤原代細胞形態(tài)圖2 常規(guī)組子宮肌瘤原代細胞形態(tài)圖3 改良組免疫組化鑒定(×100)圖4 常規(guī)組免疫組化鑒定(×100)

2.2 兩組細胞數(shù)、貼壁率和首次傳代時間比較 改良組獲取的細胞數(shù)多于常規(guī)組，貼壁率高于常規(guī)組，首次傳代時間短于常規(guī)組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組細胞數(shù)及貼壁率、首次傳代時間比較(x±s)

2.3 兩組細胞傳代次數(shù)及復蘇情況比較 改良組細胞傳代(6.60±0.83)次，常規(guī)組細胞傳代(6.33±0.72)次，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.943，P=0.356)。兩組細胞均復蘇成功。

3 討 論

子宮肌瘤體外細胞模型可用于藥物敏感性實驗及疾病機制的相關研究，但原代細胞體外培養(yǎng)困難[7]，程序復雜，無菌要求嚴格，細胞生長受到培養(yǎng)基、操作方法、培養(yǎng)環(huán)境及無菌條件等諸多因素影響[8]。具有重復性好、穩(wěn)定性強、純度高等優(yōu)點的細胞體外培養(yǎng)方法是培養(yǎng)人子宮肌瘤細胞系的關鍵，也是相關實驗的能否順利進行的基本保障[9]。

3.1 強化實驗的無菌操作 無菌操作關乎每一個實驗環(huán)節(jié)，包括標本取材過程，器械的清洗、消毒、保存，培養(yǎng)液的配置，雙抗等試劑的添加等，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏均會使細胞發(fā)生污染，導致培養(yǎng)失敗[10]。

3.2 組織塊運輸過程中緩沖液的選擇 肌瘤組織離體后，組織塊即使處于低溫環(huán)境中也仍在進行代謝。在國內多采用PBS或DMEM來暫存組織標本。PBS是只含有磷酸根、鈉、鉀、氯離子的鹽平衡緩沖液，不能為細胞提供暫時的營養(yǎng)；DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，但缺少必需的鹽離子[11]；而Hank液中鹽成分較PBS復雜，且含有葡萄糖，可為細胞提供簡單的營養(yǎng)。本研究中，改良組在取材過程中采用Hanks液代替PBS或DMEM，結果顯示改良組原代細胞貼壁率高于常規(guī)組，細胞活性高于常規(guī)組(均P<0.05)，這可能與肌瘤組織離體后Hanks液能有效保護組織細胞的活力有關。

3.3 膠原酶消化時間及二次消化 研究表明，在進行人子宮肌瘤細胞體外培養(yǎng)時，分別用膠原酶消化0.5 h和6 h，均能成功培養(yǎng)出原代子宮肌瘤細胞[5，12]。本研究中，常規(guī)組消化時間1.5～2 h，而改良組的消化時間改為4～7 h，并根據(jù)組織韌度的不同調整消化時間，如韌性大、質硬組織的消化時間相對較長。結果顯示改良組仍能獲得較多細胞，且細胞的貼壁率高于常規(guī)組(P<0.05)。這可能與二次消化可將組織深層的細胞不斷暴露于消化酶中,進而獲得更多的細胞有關。筆者還發(fā)現(xiàn)二次消化時間過長可導致細胞損傷，建議二次消化的時間為1～2 h。

3.4 兩組細胞形態(tài)及平滑肌肌動蛋白抗體對比 兩組細胞的細胞形態(tài)、大小、排列方式基本相似。α-平滑肌肌動蛋白含量變化是判斷平滑肌細胞表型變化的主要依據(jù)[13]。本研究中，免疫組化鑒定結果顯示α-平滑肌肌動蛋白抗體呈陽性反應，提示所培養(yǎng)的細胞為子宮肌瘤細胞，且細胞表型未發(fā)生明顯變化。

綜上所述，改良的人子宮肌瘤細胞培養(yǎng)方法是一種能快速獲得較多人子宮肌瘤細胞的簡便且可行的方法，能有效縮短細胞首次傳代時間，保證較多的傳代次數(shù)及較高的復蘇成功率，其所培養(yǎng)的原代細胞具有較高的貼壁率及純度。