岳 營，李晶晶，屈 滿，邱月秀，劉 冉，尹立紅，李云暉*

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]，是聚氯乙烯產(chǎn)品中應(yīng)用最廣泛的增塑劑[1]，對環(huán)境和人類健康具有潛在的風(fēng)險[2-3]，現(xiàn)已被我國列為優(yōu)先監(jiān)測的環(huán)境污染物。DEHP作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物具有類雌激素作用，在人體內(nèi)主要通過發(fā)揮類雌激素和抗雄激素作用對人體造成危害，主要的危害靶器官是生殖系統(tǒng)[4]，其中DEHP的雌性生殖毒性越來越受到關(guān)注。有研究報道，DEHP會嚴(yán)重影響卵泡的生長發(fā)育導(dǎo)致卵泡中卵母細(xì)胞核消失，隨著暴露劑量的增加出現(xiàn)閉鎖卵泡且顆粒細(xì)胞發(fā)生脫落以及排列紊亂等病理變化，從而使成熟卵泡減少[5]。但是，目前有關(guān)DEHP在卵子發(fā)生階段的毒性研究報道較少。

秀麗線蟲作為一種優(yōu)秀的模式生物已廣泛應(yīng)用于生殖毒性評價中[6]。秀麗線蟲不同時期的生殖細(xì)胞在生殖腺中整齊排列并且位置保持相對固定，從頂體細(xì)胞開始依次是有絲分裂區(qū)、過渡區(qū)(transition zone，TZ)、減數(shù)分裂區(qū)，其中減數(shù)分裂區(qū)依次是細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期以及終變期，并且各區(qū)形態(tài)不同，界限分明[7]?？梢越Y(jié)合位置和形態(tài)在顯微鏡下觀察有絲分裂區(qū)和減數(shù)分裂區(qū)生殖細(xì)胞連續(xù)的變化過程，所以秀麗線蟲是良好的觀察卵子發(fā)生過程的模型[8-9]。本研究觀察了DEHP對秀麗線蟲后代數(shù)目、有絲分裂期和減數(shù)分裂期生殖細(xì)胞數(shù)、粗線期細(xì)胞凋亡數(shù)的影響，為進(jìn)一步探討其影響卵子發(fā)生的機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 秀麗線蟲蟲株與培養(yǎng)方法

N2、MD701｛bcIs39[lim-7p：：ced-1：：GFP+lin-15(+)]｝蟲株(源自美國明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲遺傳中心)，通過使用攜帶CED-1：：GFP融合蛋白的MD701轉(zhuǎn)基因線蟲可以直接在熒光顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞[10]。線蟲均在20℃恒溫環(huán)境培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

DEHP(中國上海百靈威科技公司)；二脒基苯基吲哚(DAPI)，購于美國Sigma-Aldrich公司。Olympus SZ61體視顯微鏡、Olympus BX41生物熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。K溶液[11]和M9緩沖液[12]按參考文獻(xiàn)配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 染毒劑的配制 取DEHP液100 mg于1 mL的0.5%二甲基亞砜(DMSO)水溶液中，配成100 mg/mL的儲備液，用無菌K溶液稀釋成所需的染毒濃度，根據(jù)50%致死濃度(LC50)設(shè)定3個染毒劑量組，分別為0.1、1.0、10.0 mg/L，同時設(shè)置K溶液對照組。

1.3.2 染毒方法 選擇L4期野生型秀麗線蟲暴露染毒。染毒方式為固態(tài)培養(yǎng)基染毒法，使染毒液均勻的分布在6孔板內(nèi)。隨后將L4期線蟲置于6孔板內(nèi)，每孔最少20條線蟲，20℃下恒溫培養(yǎng)染毒48 h。

1.3.3 后代數(shù)目和世代時間的測定[13]染毒結(jié)束后，將線蟲挑到NGM培養(yǎng)基上。每隔36 h轉(zhuǎn)移至新的NGM培養(yǎng)基上，直到停止產(chǎn)卵為止，計數(shù)每條秀麗線蟲產(chǎn)生的后代數(shù)目。每個劑量組挑取20條線蟲，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。世代時間：觀察并記錄秀麗線蟲產(chǎn)第一枚卵的時間，記為T1。隨后，觀察該卵成長為成蟲后，其產(chǎn)出的第一枚卵的時間，記為T2，T2與T1之間的時間間隔即為線蟲的世代時間。

1.3.4 瞬時產(chǎn)卵量 將染毒結(jié)束的線蟲挑到新的NGM培養(yǎng)基中，4 h后計數(shù)NGM培養(yǎng)基中的受精卵數(shù)目。瞬時產(chǎn)卵量=總的受精卵數(shù)目/4。

1.3.5 生殖細(xì)胞數(shù) 染毒結(jié)束后挑取秀麗線蟲至載玻片上，避光加入2μg/mL的DAPI染液，在熒光顯微鏡下拍照。通過新月型細(xì)胞核來辨別有絲分裂區(qū)和減數(shù)分裂區(qū)，一列細(xì)胞中有2個或2個以上的新月型細(xì)胞核的區(qū)域?yàn)檫^渡區(qū)(TZ)[7]，排列在頂體末梢細(xì)胞與TZ之間的細(xì)胞為有絲分裂區(qū)細(xì)胞，TZ之后的細(xì)胞為減數(shù)分裂區(qū)細(xì)胞。

1.3.6 粗線期細(xì)胞凋亡 利用轉(zhuǎn)基因蟲株或AO染色進(jìn)行活體熒光標(biāo)記都可以用來觀察粗線期生殖細(xì)胞的凋亡情況，但是利用轉(zhuǎn)基因蟲株可以不經(jīng)過染色的程序直接在顯微鏡下進(jìn)行觀察。MD701轉(zhuǎn)基因蟲株，攜帶CED-1：：GFP，其可以識別凋亡細(xì)胞并聚集到凋亡細(xì)胞周圍，使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)亮綠色的圓形紐扣狀[14]，本實(shí)驗(yàn)利用MD701轉(zhuǎn)基因蟲株觀察粗線期生殖細(xì)胞凋亡。將染毒后的MD701蟲株用M9溶液清洗干凈后置于2%瓊脂凝膠上，滴加0.025 mmol/L鹽酸左旋咪唑20μL麻醉線蟲，在熒光顯微鏡下觀察凋亡情況。計數(shù)線蟲單側(cè)性腺臂中凋亡細(xì)胞的數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果采用xˉ±s表示，后代數(shù)目、世代時間、生殖細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞凋亡數(shù)采用單因素方差分析，不同劑量組與對照組之間的比較采用Dunnet’s t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DEHP對秀麗線蟲生殖能力的影響

結(jié)果見圖1，與對照組相比，當(dāng)DEHP的濃度為1.0和10.0 mg/L時，秀麗線蟲的后代數(shù)目和瞬時產(chǎn)卵量均下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，而各劑量組秀麗線蟲的世代時間差異不明顯(P均＞0.05)。

圖1 DEHP染毒對秀麗線蟲生殖能力的影響

2.2 DEHP對秀麗線蟲生殖細(xì)胞數(shù)目的影響

結(jié)果見圖2。當(dāng)DEHP的染毒濃度為0.1、1.0、10.0 mg/L時，線蟲的總生殖細(xì)胞數(shù)減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)，且隨著染毒劑量的增加，生殖細(xì)胞數(shù)逐漸減少(P＜0.01)。與對照組相比，有絲分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)在1.0和10.0 mg/L染毒組出現(xiàn)明顯下降(P均＜0.01)，減數(shù)分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)在0.1～10 mg/L染毒組均出現(xiàn)明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 DEHP染毒對生殖細(xì)胞數(shù)目的影響

2.3 DEHP對線蟲粗線期凋亡的影響

結(jié)果見圖3，與對照組相比，在0.1 mg/L的DEHP暴露下，粗線期生殖細(xì)胞的凋亡數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)DEHP染毒劑量為1.0和10.0 mg/L時，粗線期生殖細(xì)胞的凋亡數(shù)顯著增多，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。

圖3 DEHP染毒后，秀麗線蟲MD701突變株粗線期細(xì)胞的凋亡情況

3 討論

有研究表明，DEHP影響卵泡的發(fā)育導(dǎo)致成熟卵泡減少，閉鎖卵泡增多，從而導(dǎo)致生殖能力的下降，生殖器官畸形等[15]。DEHP可以通過擾亂卵泡的生長發(fā)育和成熟以及抑制排卵，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮其生殖毒性，破壞卵巢功能，影響生殖能力[16-17]。但有關(guān)其影響卵子的發(fā)生以及相關(guān)雌性生殖毒性機(jī)制的研究較少。秀麗線蟲已成為一種較為成熟的模式生物，其生殖細(xì)胞在性腺中的位置固定，利用熒光染料在顯微鏡下易于區(qū)分和觀察，在生殖毒性的研究中具有一定的優(yōu)勢[18]。

本試驗(yàn)中，我們首先探討了DEHP染毒后對秀麗線蟲后代數(shù)目、世代時間和瞬時產(chǎn)卵量等基本生殖指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1.0和10.0 mg/L劑量下DEHP可以導(dǎo)致秀麗線蟲后代數(shù)目和瞬時產(chǎn)卵量的減少，但對世代時間無明顯影響。性腺生殖細(xì)胞數(shù)是評價外源化學(xué)物生殖毒性的重要指標(biāo)之一[19]。結(jié)果表明，在1.0和10.0 mg/L DEHP暴露后會導(dǎo)致秀麗線蟲總的生殖細(xì)胞數(shù)顯著下降，這一結(jié)果與前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[20]，基于這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為DEHP暴露后導(dǎo)致秀麗線蟲后代數(shù)目、瞬時產(chǎn)卵量等生殖能力的下降可能與總生殖細(xì)胞數(shù)的減少有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.0和10.0 mg/L劑量DEHP暴露后，秀麗線蟲有絲分裂區(qū)和減數(shù)分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)也相繼減少。由此提示，DEHP不僅影響了卵子發(fā)生過程中有絲分裂區(qū)的增殖能力導(dǎo)致細(xì)胞增殖阻滯，而且對減數(shù)分裂區(qū)生殖細(xì)胞的分化能力也產(chǎn)生了影響。

在正常的生理情況下，秀麗線蟲粗線期生殖細(xì)胞會發(fā)生生理性的細(xì)胞凋亡，當(dāng)受到外界刺激時，細(xì)胞的凋亡數(shù)目會增加[21]。我們利用秀麗線蟲突變株MD701來觀察生殖細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著DEHP染毒劑量的升高，粗線期凋亡的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。目前有研究表明，DEHP會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，因此，我們認(rèn)為DEHP暴露會導(dǎo)致秀麗線蟲粗線期凋亡數(shù)目增多，從而導(dǎo)致減數(shù)分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)目下降。

綜上所述，DEHP暴露可以導(dǎo)致秀麗線蟲有絲分裂區(qū)增殖阻滯和減數(shù)分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少，并伴隨粗線期細(xì)胞凋亡增加。這一結(jié)果提示DEHP可以通過誘導(dǎo)粗線期凋亡數(shù)增多進(jìn)而減少有絲分裂區(qū)和減數(shù)分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)，從而導(dǎo)致后代數(shù)目下降，這可能是DEHP影響雌性生殖毒性的機(jī)制之一。