劉 靜，張小強，*，王 旭，苗歆雨，盧曉星

(1．東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；2．東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009)

近年來，用于食品的二氧化鈦(titanium dioxide，TiO2)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)和歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)認定為是一種安全的食品添加劑[1]。然而，Kim等[2]在標(biāo)注含TiO2的食品中檢測出一定量的納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，nano-TiO2)。腸道是大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的場所，易與經(jīng)口攝入的外來污染物相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口暴露的nano-TiO2富集在腸道上皮細胞層[3]，誘導(dǎo)腸道隱窩結(jié)構(gòu)改變以及緊密連接蛋白和炎癥相關(guān)基因表達異常[4-5]。上述病理表現(xiàn)提示腸道可能作為nano-TiO2的靶器官之一，出現(xiàn)不良反應(yīng)。迄今為止，有關(guān)nano-TiO2腸道毒性的研究相對較少?？紤]到人群每日經(jīng)口暴露于nano-TiO2的機會增加，關(guān)于nano-TiO2腸道毒性效應(yīng)及相關(guān)機制值得深入探討。因此，本研究選擇不同濃度的nano-TiO2刺激腸道上皮細胞(intestinal epithelial cells，IEC-6)，觀察 nano-TiO2對細胞活性和炎癥因子表達的影響，探討nano-TiO2是否導(dǎo)致IEC-6細胞炎癥反應(yīng)及相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要材料和試劑 大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)購于中國科學(xué)院昆明細胞庫；nano-TiO2粉末，購于德國Degussa公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液購于美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于美國Sigma公司；IL-1β、IL-6和TNF-α雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購于北京康為世紀生物技術(shù)有限公司；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體、山羊抗兔二抗IgGHRP、Western blot魯米諾試劑均購于美國Santa Cruz公司。

1.1.2 主要儀器 Olympus IX51倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司；Esco二氧化碳培養(yǎng)箱購于新加坡Esco公司；JEM-2100型透射電鏡購于日本JEOL公司；Zetasizer Nano-ZS90型馬爾文粒徑分析儀購于英國馬爾文儀器有限公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀購于美國Rayto公司；5417R高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司；Mini-Protein 3小型垂直電泳槽購于美國Bio-Rad公司；DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳槽購于北京六一儀器廠；JY600C電泳儀購于北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備nano-TiO2染毒懸液 使用電子天平精確稱量10.0 mg nano-TiO2粉末，120℃加熱2 h殺菌處理，加入10 mL完全培養(yǎng)基配成1 mg/mL的母液，置于4℃冰箱保存待用。使用前100 Hz超聲震蕩30 min，根據(jù)實驗需要稀釋成相應(yīng)濃度。

1.2.2 腸道上皮細胞的培養(yǎng) 將大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，每3～4 d傳代一次。當(dāng)細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行實驗。

1.2.3 nano-TiO2顆粒表征 取nano-TiO2懸液滴加在銅網(wǎng)上并烘干，在樣品表面鍍上具有導(dǎo)電性的金膜，將樣品放入透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)樣品倉，在加速電壓200 kV下，觀察nano-TiO2的粒徑。取一定量的nano-TiO2染毒懸液，超聲處理30 min，使用馬爾文粒徑分析儀檢測nano-TiO2的平均水合粒徑、分散系數(shù)(polydispersity，PDI)和Zeta電位。

1.2.4 MTT法測定細胞存活率 待IEC-6細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整濃度為1×105個/mL，以每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后分為調(diào)零組、對照組和nano-TiO2處理組(濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL)培養(yǎng)24 h，每組5個復(fù)孔。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清。每孔加150μL的DMSO，震蕩5～10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測吸光度D(570)值，并計算細胞存活率。

1.2.5 ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α水平 將對數(shù)生長期的IEC-6細胞調(diào)整濃度為2×105個/mL，以每孔500μL接種于24孔培養(yǎng)板上，待細胞貼壁后，實驗分組同1.2.4，處理24 h后取細胞培養(yǎng)液上清3 000 r/min離心20 min，收集離心后的培養(yǎng)液上清。各細胞因子水平應(yīng)用ELISA雙抗體夾心法測定，按照ELISA試劑盒說明書進行，操作完畢后用酶標(biāo)儀測定吸光度D(450)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別確定樣品中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.2.6 Western blot法檢測JAK2/STAT3蛋白表達及其磷酸化水平 將處于對數(shù)生長期的IEC-6細胞以濃度為6×105個/mL接種于直徑為6 cm培養(yǎng)皿中，細胞貼壁后，分組同1.2.4，加入nano-TiO2。用RIPA裂解液提取蛋白，在4℃、12 000 r/min條件下，離心15 min，吸取上清，-80℃冰箱保存。用BCA蛋白定量試劑盒確定所得蛋白濃度后，在制備好的分離膠中加入樣品，SDS-PAGE電泳，待溴酚藍到達下層膠的底部停止電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于封閉液中37℃封閉2 h，加入成比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜，加入1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，ECL顯影，使用Image J軟件掃描分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組之間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。兩兩比較時，若方差齊則采用LSD-t檢驗；若不齊則選擇Dunnett’s T3檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 nano-TiO2的表征

TEM檢測結(jié)果見圖1，顯示分散在細胞培養(yǎng)基中的nano-TiO2形態(tài)不規(guī)則，顆粒團聚。粒徑儀檢測到顆粒的平均水合粒徑為(64.59±2.05)nm，PDI為(0.23±0.01)，Zeta電位為(-5.27±0.21)mV，上述結(jié)果提示nano-TiO2的混合分散體系較為穩(wěn)定。

圖1 nano-TiO2表征

2.2 nano-TiO2對IEC-6細胞存活率的影響

MTT法測定細胞存活率結(jié)果見圖2，與對照組相比，各個nano-TiO2處理組(5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL)IEC-6細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明本試驗濃度的nano-TiO2對IEC-6細胞活性未產(chǎn)生明顯影響。

圖2 nano-TiO2對IEC-6細胞存活率的影響

2.3 nano-TiO2誘導(dǎo)IEC-6細胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α因子

ELISA法測定IEC-6細胞分泌炎癥因子結(jié)果見圖3，IEC-6 細胞給予 10.0、15.0、20.0 μg/mL nano-TiO2染毒處理后，與對照組相比，細胞IL-1β分泌增加(P＜0.05)；與對照組相比，nano-TiO2各個濃度(5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL)作用組中IEC-6細胞IL-6和TNF-α水平均明顯升高(P＜0.05)，且nano-TiO2染毒劑量與上述促炎性因子分泌水平呈劑量依賴性增加(rIL-1β=0.870， P＜0.01； rIL-6=0.938， P＜0.01； rTNF-α=0.982，P＜0.01)。

2.4 nano-TiO2引起IEC-6細胞JAK2/STAT3蛋白磷酸化

圖3 nano-TiO2對IEC-6細胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響

Western blot實驗的結(jié)果見圖4，與對照組相比，在濃度為15.0和20.0μg/mL nano-TiO2作用下p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平明顯增加(圖4A)，且p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平與炎癥因子分泌水平呈正相關(guān)關(guān)系(rJAK2，IL-1β=0.561，P＜0.05；rJAK2，IL-6=0.711，P＜0.01；rJAK2，TNF-α=0.675，P＜0.01；rSTAT3，IL-1β=0.782，P＜0.01；rSTAT3，IL-6=0.532，P＜0.05；rSTAT3，TNF-α=0.668，P＜0.01)?；叶戎捣治鼋Y(jié)果(圖4B和圖4C)顯示，IEC-6細胞在15.0和20.0μg/mL nano-TiO2作用下，JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 nano-TiO2對IEC-6細胞JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平的影響

3 討論

納米顆粒作為一種新興材料，因其具有特殊的物理化學(xué)特性被使用于工業(yè)、生物醫(yī)藥[6]和食品行業(yè)[7]。隨著應(yīng)用途徑多樣化，納米顆?？呻S食品經(jīng)口分布于機體腸道。腸道中的腸道屏障主要由腸道上皮細胞和細胞間的緊密連接構(gòu)成，能有效隔離外源性有害物質(zhì)到達機體內(nèi)部。當(dāng)腸道屏障遭到破壞，可能誘導(dǎo)腸道炎性疾病發(fā)生，進而導(dǎo)致結(jié)直腸癌[8]。因此，評價nano-TiO2對腸道上皮細胞的毒性效應(yīng)對nano-TiO2的安全性評估具有重要意義。

本實驗結(jié)果表明，nano-TiO2對體外培養(yǎng)的IEC-6細胞存活率無顯著影響，這與YE等[9]的研究一致。一般來說，nano-TiO2的毒性具有時間和劑量依賴性[10-11]。而本研究的IEC-6細胞僅單次暴露于較低濃度的nano-TiO2且接觸時間較短(24 h)，可能尚未表現(xiàn)出nano-TiO2的細胞毒性?？紤]到各年齡段人群每日經(jīng)口攝入nano-TiO2的頻率和用量的差異性[12]，未來可能需要進行高劑量和長期染毒實驗進一步確證重復(fù)暴露nano-TiO2對人體腸道的影響。

一項有關(guān)金屬納米毒性對比的研究發(fā)現(xiàn)，不同的金屬納米顆粒對細胞活性的影響差異較大，但是卻都能引起細胞相關(guān)炎性因子分泌[13]。所以，本研究在發(fā)現(xiàn)nano-TiO2不影響IEC-6細胞活性后，我們對nano-TiO2能否引起腸道細胞炎癥反應(yīng)進行評估。本實驗結(jié)果表明，較低濃度的nano-TiO2(5和10μg/mL)就能刺激細胞顯著分泌炎性相關(guān)因子。這可能是因為細胞將納米顆粒識別為外源性物質(zhì)，極低濃度的nano-TiO2(1×10-3μg/mL)也可能引起細胞一系列炎性反應(yīng)[14]。然而，Tada-oikawa等[15]發(fā)現(xiàn)高于25 μg/mL nano-TiO2濃度作用下，腸道細胞才開始分泌較高水平的IL-1β。出現(xiàn)相悖結(jié)果的原因可能是不同細胞種屬對nano-TiO2敏感性不一[16]，導(dǎo)致反應(yīng)濃度出現(xiàn)差異。另外，根據(jù)晶型分類，常見的nano-TiO2主要來源有3種：銳鈦礦、金紅石和板鈦礦。本實驗采用的是與食品添加劑成分相似的銳鈦礦與金紅石混合物[17]，而Tada-oikawa等[15]的研究選用100%純度的銳鈦礦染毒。nano-TiO2成分差異可能是導(dǎo)致不同結(jié)果的原因之一。

JAK2/STAT3通路是參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要通路之一。有研究分析發(fā)現(xiàn)，IL-6的表達與STAT3磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系[18]。本實驗在nano-TiO2刺激下，IEC-6細胞中JAK2蛋白和STAT3蛋白磷酸化水平增加，說明JAK2/STAT3信號通路可能被激活。隨著nano-TiO2劑量增加，JAK2/STAT3兩種蛋白磷酸活化水平與3種炎癥相關(guān)因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌水平變化趨勢一致。因此，我們推斷nano-TiO2引起腸上皮細胞炎癥因子的表達可能與JAK2/STAT3蛋白磷酸活化相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，JAK2通路抑制劑(AG490)能大幅度緩解JAK2/STAT3蛋白的激活和相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生[19]，這提示JAK2/STAT3信號通路參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。今后，我們將利用JAK2/STAT3通路的抑制劑探索nano-TiO2是否通過JAK2/STAT3信號通路誘導(dǎo)IEC-6細胞分泌炎癥因子。Fukatsu等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2的炎癥反應(yīng)在核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制劑作用下逐漸減輕，表明NF-κB通路同樣參與納米引起的炎癥反應(yīng)。除此之外，nano-TiO2暴露伴有炎癥產(chǎn)生的同時還引起小鼠中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表達上調(diào)[21]以及細胞中蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK等蛋白磷酸化水平增加[22-23]。由此，我們推斷nano-TiO2致生物體產(chǎn)生炎性反應(yīng)可能與多條信號通路有關(guān)，涉及JAK2/STAT3、MAPK家族和PKB等傳導(dǎo)途徑。