張麗霞，顧 雯，張宏偉，段 鏈*

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所毒理室，北京 100021)

納米銅是代表性的金屬納米材料之一，作為商業(yè)化產(chǎn)品進入市場多年，在生物醫(yī)學領(lǐng)域中有望代替銅化合物或微米銅材料而得到廣泛應(yīng)用。然而，已有研究表明納米粒子所具有的小尺寸、大的比表面積及高表面活性等特征使其具有一些可能的健康危害[1-2]。納米銅在體內(nèi)、外實驗中均顯示出毒性作用[3]。研究表明氧化銅納米顆粒(CuO-NPs)可能影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[4-5]。腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)是一種薄而扁平、內(nèi)襯在大腦毛細血管內(nèi)壁且與血液直接接觸的磷狀細胞。由BMECs組成的大腦微血管構(gòu)建出高選擇性的屏障，很大程度上決定了各種物質(zhì)對血腦屏障的通透程度。BMECs之間通過其細胞膜側(cè)壁相關(guān)聯(lián)，接觸面上有緊密連接蛋白和粘附蛋白[6-7]。BMECs擁有特殊的基底膜結(jié)構(gòu)，是維持血腦屏障的重要部件[8]。作為血腦屏障的主要組成部分之一，BMECs被認為是血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)物質(zhì)相互交換的主要場所，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著十分重要的作用。

細胞毒性測定是一種最直接反映體外培養(yǎng)細胞損傷的指標，也是研究外源化學物質(zhì)毒作用機制的最關(guān)鍵步驟。刃天青是常用的一種細胞毒性檢測劑，在細胞增殖過程中將無熒光性的刃天青還原為熒光產(chǎn)物，利用熒光分光光度計檢測所得的熒光強度與活細胞數(shù)成正比[9]。實時細胞分析(real time cell analyze，RTCA)是一種新興的監(jiān)測活細胞狀態(tài)的方法[10]，RTCA基于微電子阻抗技術(shù)利用細胞指數(shù)(cell index，CI)反映細胞活性，可根據(jù)需要進行實時測定。檢測記錄的CI值為無量綱單位，可反映貼壁細胞的數(shù)量、形態(tài)及粘附能力等特征。

本研究利用RTCA法和刃天青法測定CuO-NPs對BMECs的毒性，比較兩種方法用于納米顆粒毒性測定的優(yōu)劣勢，分析RTCA法用于納米顆粒細胞毒性測定的適用性。同時獲得CuO-NPs作用于BMECs所產(chǎn)生的細胞毒性結(jié)果，為進一步深入研究金屬納米顆粒的對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)提供相關(guān)實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器

連續(xù)波長微孔板分光光度計(Multiskan GO，美國Thermo公司)；Real-Time Cell Analyzer及配套16孔板由艾森生物有限公司[ACEA生物(杭州)有限公司]生產(chǎn)，此配套16孔板每孔底面積0.32 cm2，與常規(guī)96孔板規(guī)格一致；Zxis 165 X射線光電子能譜(XPS)系統(tǒng)(Kratos Analytical)；JEM-2100F透射電子顯微鏡(TEM)(JEOL Ltd.Japan)；納米粒度Ζ電位儀(Malvern Instruments.Ltd.，UK)。

1.2 細胞分離和培養(yǎng)

新生SD大鼠(出生后24 h)購自中國實驗動物資源研究所(生產(chǎn)許可證SCXK2014-0013)。在分離培養(yǎng)BMECs之前確保所有的工具無菌，所有操作都在冰上進行，用無菌的多聚賴氨酸包被所需材料(12孔培養(yǎng)皿)。在解剖顯微鏡下，用一對小鑷子將新生SD大鼠帶有海馬和皮層的大腦與頭骨分離，然后放入盛有冰冷HBSS的培養(yǎng)皿中，將大腦兩半球分開，用鑷子將多余的腦膜剝離，并分離海馬和大腦皮層。用冰冷的HBSS清洗兩次。分離的大腦皮層通過200和70μm的篩網(wǎng)均勻化，神經(jīng)膠質(zhì)細胞隨濾液棄除，70μm篩網(wǎng)上存留的大部分即為BMECs。70μm篩網(wǎng)上存留物在37℃下用II型膠原酶(0.2%)消化20 min。消化后，室溫下200 g離心5 min，收集微血管碎片并接種到聚-D-賴氨酸包被的培養(yǎng)皿上，加入完全細胞培養(yǎng)液DMEM(Gibco，USA)，其中含有10%胎牛血清(FCS，Gibco，USA)、30μg/mL內(nèi)皮細胞生長因子(Sigma)和1%雙抗，于37℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞融合達到80%時，用1.25 mg/mL的胰酶進一步純化，并經(jīng)2～4代傳代純化后，得純化的BMECs用于后續(xù)實驗。

1.3 納米粒子

1.3.1 納米氧化銅顆粒的表征 納米氧化銅(CuONP，純度99%)購自DK(北京)納米技術(shù)有限公司。根據(jù)制造商的規(guī)格，粒徑為10～100 nm，體積密度為0.79 g/cm3，質(zhì)量濃度為30%，比表面積為13.1 m2/g，以分散在去離子水中的懸浮液形式獲得納米顆粒。使用X射線光電子能譜(XPS)測定納米顆粒的元素組成。用JEM-2100F透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒的形狀。

將納米氧化銅顆粒加入到BMECs培養(yǎng)液中，使其終濃度為最高染毒濃度，輕輕旋轉(zhuǎn)并吹打，以確保顆粒完全分散，用納米粒度Ζ電位儀測定高濃度受試物的Ζ電位，同時以動態(tài)光散射法測定其水合粒徑，以確定染毒后納米氧化銅的團聚情況。

1.3.2 納米顆粒分散體 使用130 W超聲波處理器(Cole-Parmer Instruments，Vernon Hills，IL)將所有分散體以70%振幅超聲處理5 min。測定其pH值(pH值穩(wěn)定在6～7即可)。在4℃下儲存分散體至少24 h，并在使用前立即超聲處理5 min。

1.4 RTCA實時監(jiān)測技術(shù)測定細胞毒性

1.4.1 細胞生長和增殖測定 取生長狀態(tài)良好的BMECs細胞用DMEM完全培養(yǎng)液充分混勻，按不同密度接種于RTCA配套16孔板中，每孔50μL。細胞濃度梯度分別設(shè)置為 1.56×102、3.13×102、6.25×102、1.25×103、2.50×103、5.00×103和1.00×104個/mL，每個濃度設(shè)2個復(fù)孔。RTCA程序設(shè)置15 min進行一次細胞指數(shù)(cell index，CI)值的測試。CI值為RTCA以基于微電子阻抗的檢測技術(shù)進行細胞活性檢測的細胞指數(shù)單位，為無量綱單位，所代表的是成活的貼壁細胞。通過對不同密度的細胞進行連續(xù)測定，以細胞CI值為Y軸，以時間為X軸繪制生長曲線，通過比較生長曲線斜率判斷細胞的生長速度，確定適合于毒性實驗的最終細胞濃度進行下一步毒性實驗。

1.4.2 實時監(jiān)測CuO-NPs細胞毒性 根據(jù)已繪制出的細胞生長曲線，選擇適當?shù)募毎麧舛冉臃N于配套16孔板中，每孔100μL。置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)約24 h后進行染毒。CuONPs設(shè)置5個不同染毒劑量及空白對照組，分別為1.5、0.75、0.38、0.19、0.09、0 mg/mL，每個劑量設(shè)2個復(fù)孔。

RTCA程序設(shè)置為細胞接種后自然生長，每15 min測定一個點，測定自細胞接種時為起始點，第100小時測定結(jié)束。以時間為X軸，歸一細胞指數(shù)(normalized cell index，NCi)值為Y軸繪制細胞生長曲線，觀察不同劑量CuO-NPs所產(chǎn)生的細胞毒性。本實驗將染毒時刻作為校正時間點，NCi值為1，之后各時間點各濃度的CI值均與染毒時刻相比，按下式計算求得NCi值。

式中：NCi——歸一細胞指數(shù)；CI(Tk)——染毒前最后一個時間點的細胞指數(shù)；CI(Ti)——被測定的時間點的細胞指數(shù)；N——所有被測定時間點。

1.5 刃天青法測定納米氧化銅的細胞毒性

根據(jù)細胞生長曲線，選擇與RTCA法相同的細胞濃度接種于96孔板中，每孔100μL。置于37℃，CO2體積分數(shù)為5%，飽和濕度下培養(yǎng)約24 h后進行染毒。納米氧化銅染毒劑量組與RTCA法一致，每個劑量設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組。共接種5塊96孔板，分別在染毒3、12、24、36和48 h共5個時間點進行測定。染毒時間到達確定時間點后，各孔加入配制好的刃天青溶液，10μL/孔，終濃度為5μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用連續(xù)波長微孔板分光光度計進行檢測，激發(fā)光波長530 nm，發(fā)射光波長590 nm。細胞存活率/%=×

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CuO-NPs的表征

透射電子顯微鏡圖像顯示CuO-NPs是不規(guī)則形狀的晶體形式(圖1)。XPS分析顯示CuO-NPs由Cu和O組成。將CuO-NPs加入到BMECs完全培養(yǎng)液中，終濃度為最高染毒濃度1.5 mg/mL，Ζ電位測定結(jié)果表明，CuO-NPs在BMECs培養(yǎng)液中的Ζ電位為(-36.5±6.59)mv，水合粒徑為(189.12±25.68)nm。CuO-NP樣品在培養(yǎng)基中的Ζ電位絕對值較大，說明樣品在培養(yǎng)基中的懸浮相對穩(wěn)定。水合粒徑結(jié)果表明，CuO納米顆粒在細胞培養(yǎng)基中均形成團聚。其他關(guān)于納米顆粒的研究中也得到類似結(jié)果[11-12]。

圖1 CuO-NP的透射電子顯微鏡圖像結(jié)果

2.2 RTCA法測定BMECs細胞毒性

2.2.1 細胞增殖的測定 本研究對BMECs進行細胞增殖分析以獲得細胞毒性實驗的最佳細胞接種數(shù)及最佳染毒時間。結(jié)果如圖2所示，以15 min的間隔觀察細胞特征，垂直藍線表示細胞粘附和擴展的初始階段，紅線表示接種后的不穩(wěn)定狀態(tài)，在細胞接種的初始階段(0～20 h)BMECs的CI值增加，這可能與細胞的附著和粘附有關(guān)，隨后達到短暫的平臺期。接后種40 h開始，CI值又逐漸升高，說明細胞從這個時間點開始大量增殖，進入快速生長期。因此，后續(xù)試驗研究建議在BMECs接種后40 h作為染毒時間點。

圖2 BMECs生長曲線

另外，1.0×104和5.0×103個/孔的兩組細胞CI曲線隨著時間的增加顯示下降趨勢。這可能是由于高密度BMECs會影響細胞生長。2.5×103個/孔細胞在染毒時間點細胞CI值快速增加并在受試時間內(nèi)達到平臺期，說明此細胞數(shù)量在受試時間內(nèi)處于快速增殖期并達到穩(wěn)定。從1.25×103及2.5×102個/孔兩組細胞CI值生長曲線可見，到受試時間內(nèi)該兩組細胞一直處于增殖階段，說明此兩組細胞數(shù)量不足，在快速生長期內(nèi)沒有到達快速增殖狀態(tài)。因此，選擇每孔2.5×103個細胞作為細胞染毒的最佳數(shù)量。

2.2.2 細胞毒性測定 每孔選擇2.5×103個BMECs細胞作為細胞染毒的最佳接種數(shù)量，接種后約40 h進行染毒。以時間為X軸，歸一細胞指數(shù)(NCi)值為Y軸繪制細胞生長曲線，觀察不同劑量CuO-NPs所產(chǎn)生的細胞毒性，如圖3所示。結(jié)果顯示BMECs在0.38、0.75、1.5 mg/mL染毒后2～3 h引起瞬間不穩(wěn)定，之后是漸進死亡，這可能是由于納米顆粒本身的特征，如擴散后沉積、團聚等，導(dǎo)致其進入大分子的細胞培養(yǎng)體系后而產(chǎn)生的影響，而非毒性作用所致。此外，0.75、1.5 mg/mL組BMECs的NCi值在染毒后約2 h開始降低并在4 h內(nèi)降至約0。其他染毒劑量組的毒性效應(yīng)曲線可觀察到近似劑量依賴性趨勢。

圖3 RTCA測定CuO-NPs對BMECs的細胞毒性

2.3 刃天青法測定CuO-NPs的細胞毒性

為了比較從RTCA系統(tǒng)獲得的結(jié)果，在染毒3、12、24、36和48 h時，通過刃天青法測量細胞活力。不同染毒時間下的細胞活力見圖4。BMECs暴露于1.5和0.75 mg/mL的CuO-NPs時所產(chǎn)生的細胞毒性最大。CuO-NP劑量0.09 mg/mL染毒24 h以內(nèi)、0.19 mg/mL染毒3 h細胞活力與對照組(0 mg/mL)無顯著差異，其它受試劑量組各染毒時間點細胞活力均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。并且各染毒劑量組可觀察到劑量依賴性細胞毒性。可見刃天青法測定結(jié)果與RTCA獲得的結(jié)果相似。

圖4 刃天青法測定CuO-NPs的細胞毒性

2.4 RTCA及刃天青法所測CuO-NPs對于BMECs細胞IC50值的比較

本研究在兩種毒性測定方法中都觀察到類似的劑量依賴性，因此選擇相同的暴露時間點(染毒3、12、24、36、48 h)計算其IC50值。RTCA方法通過RTCA分析系統(tǒng)計算各時間點的IC50值及回歸系數(shù)R2，刃天青法通過擬合曲線計算Logistic回歸系數(shù)R2值。結(jié)果如表1所示。

利用SPSS 16.0軟件將兩種方法在5個時間點測得的BMECs細胞IC50值進行統(tǒng)計分析，相關(guān)性分析顯示兩種方法所得IC50值相關(guān)系數(shù)為0.999，P=0.000，具有相關(guān)性。配對t檢驗結(jié)果顯示，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.125，P=0.323)。從計算IC50的R2值來看，RTCA擬合曲線R2值高于刃天青法Logistic回歸系數(shù)R2值。

表1 兩種方法檢測CuO-NPs作用于BMECs不同暴露時間的IC50值及R 2值

3 討論

細胞毒性測定是外源性化學物質(zhì)體外機制研究的關(guān)鍵，也是毒性效應(yīng)研究的基礎(chǔ)。本研究通過采用2種毒性測定方式相比較的方法，研究納米氧化銅對原代BMECs細胞的毒性作用，以探討適用于納米顆粒物的細胞毒性測定方法。

而納米材料本身具有體積效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等特殊的物理特性，可能產(chǎn)生特有的細胞毒性作用[13]。常規(guī)的細胞毒性測定方法所得結(jié)果為某一個或幾個時間點的數(shù)值，用于測定粒徑僅為1～100 nm范圍的納米粒子，可能會出現(xiàn)忽略納米材料作用于細胞毒性變化過程的情況。而RTCA是一種實時細胞分析技術(shù)，它基于微電子阻抗原理，反映細胞活性的無標記連續(xù)監(jiān)測活細胞狀態(tài)，不受受試物本身形態(tài)的影響，可避免納米顆粒物易團聚而對結(jié)果產(chǎn)生的影響。另外，RTCA技術(shù)可根據(jù)需要進行實時測定，反映貼壁細胞的數(shù)量、形態(tài)及粘附能力等特征的綜合指數(shù)，可反映整個毒性作用過程的變化情況。然而，RTCA方法是一種新興的細胞毒性檢測技術(shù)，其應(yīng)用于納米顆粒毒性測定的適用性及準確性還需經(jīng)過多方面驗證。因此本研究將RTCA方法與目前已被認可的常用的細胞毒性檢測方法刃天青法進行比較。從分析結(jié)果中可以看出，兩種方法所獲得IC50值相關(guān)系數(shù)為0.999，P=0.000，具有相關(guān)性。通過配對t檢測結(jié)果可見此兩種方法的結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，說明這兩種方法所得毒性結(jié)果在趨勢上具有一致性，RTCA方法適合于納米顆粒的細胞毒性測定。并且從計算IC50擬合曲線的R2值來看，RTCA擬合曲線R2值高于刃天青法Logistic回歸系數(shù)R2值，說明RTCA所得結(jié)果更為精確。另外，RTCA方法可以實時監(jiān)測到細胞的生長狀態(tài)、提供動態(tài)分析數(shù)據(jù)、并可以觀測到細胞毒性開始的起始點及整個生長過程中的變化，更為詳細、準確的提供毒性數(shù)據(jù)結(jié)果，因此相比于經(jīng)典的細胞毒性測試方法，更具優(yōu)勢。

本研究通過RTCA對不同接種濃度的BMECs進行細胞增殖分析，建立了BMECs完整生長周期的生長曲線，獲得了細胞進行快速生長期的時間點并篩選出最佳接種濃度，確定后續(xù)試驗研究的染毒時間為接種后40 h，最佳接種濃度為2.5×103個/孔，對于后續(xù)研究CuO-NP對血腦屏障功能影響的機制研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐。